MHC-I 限制性表位中的 SARS-CoV-2 突变逃避 CD8 + T 细胞反应.docx

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1、MHC-I限制性表位中的SARS-CoV-2突变逃避CD8+T细胞反应抽象的对SARS-CoV-2的CD8*T细胞免疫与C0VID-19的严重程度和病毒控制有关。在这里，我们在对747个SARS-CoV-2病毒分离株进行深度测序后，在MHC-I限制性CD87细胞表位中发现了非同义突变.在无细胞体外测定中，突变肽表现出减少或消除的MHC-I结合。突变肽的MHC-I结合减少与从HLA匹配的C0VID-19患者中分离的CD8一细胞的增殖、IFN-Y产生和细胞毒活性减少有关。离体扩增的单细胞rm测序，四聚体分选的CD8一来自C0VID-19患者的T细胞进一步揭示了对突变肽的转录反应存在质的差异。我们的

2、研究结果强调了SARS-CoV-2通过MHC-I限制性病毒表位中的点突变破坏CD8+1细胞监视的能力。介绍逊至外2感染引起先天性和适应性免疫臂的广泛激活(1-42。保护的主要相关因素是中和抗体和细胞毒性CD8+T淋巴细胞(CTL)(5)0CTL在赋予免疫记忆和抵御病毒病原体（-）方面发挥着重要作用。CTLs在识别病毒表位后杀死受感染的细胞，因为它们在I类主要组织相容性复合物蛋白（MHC-I）的背景下显示在细胞表面。这些表位中的某些位置已被证明对MHC-I呈递至关重要，而这些所谓的锚定残基中的突变可能会干扰肽与MHC-I的结合（g,10）oCTL反应已在SARS-CoV-2感染患者中得到详细描述

3、（3,4,11-15在急性SARS-CoV-2感染中，CTL显示出高水平的细胞毒性效应分子，例如颗粒酶B、穿孔素和IFN-y（左）。许多人类白细胞抗原（HLA）限制性CTL表位已被表征为SARS-CoV-2（4,17-22）0CTL介导控制导致慢性感染（如HIV和HCV）的RNA病毒的令人信服的进化证据是由病毒表位中发生的突变提供的,这些突变直接干扰CTL利MHC-I限制性T细胞抗原的识别和杀伤（24-272。虽然最近SARS-CoV-2中的一些突变与逃避抗体反应有关（经-30）,SARS-CoV-2突变可能在多大程度上颠覆病毒衍生肽通过MHC-I的呈递仍有待确定。在这项研究中，我们使用深度病

4、毒基因组测序来识别先前报道的MHC-I表位中的非同义突变。我们结合了无细胞体外试验以及C0VID-19患者衍生的PBMC的功能和转录表征，以研究MHC-I表位中单点突变逃避CTL反应的潜力。结果推定的SARS-CoV-2CD8+T细胞表位突变的生物信息学分析为了评估病毒突变对SARS-CoV-2特异性CD8+T细胞反应的可能影响，我们对747个SARS-CoV-2样本进行了深度病毒基因组测序（20,000X覆盖率）（图S1A）和生物信息学分析（21）。我们专注于27个CTL表位，这些表位之前曾被报道为受HLA-A*02:01（奥地利等位基因频率0.29）或HLA-B*40:01（奥地利等位基因

5、频率0.03-0.05）限制的实验验证表位（4,17-20,31）o大多数选定的表位位于S蛋白（N=13）中，其余表位分布在N（N=6）、ORFlab（N=4）、M（N=3）和E（N=l）之间）蛋白质。肽的详细描述及其三字母代码列于表Slo在这些表位中，我们在229个样本中检测到194个非同义突变，频率N0.02（图1A-B）o在这194个变体中，有35个的频率在0.1到0.5之间。值得注意的是，9个变体是固定的（频率10.9）并在53个不同的患者样本中发现（表S2）o由于某些表位重叠，这194个突变导致199个不同的表位变体。这些突变中有41个定位于锚定残基，21个突变影响辅助残基，它们都是

6、MHC-I肽加载的组成部分（图S1B）（9、10o通过NetMHCpanv4.1（32）预测野生型和突变肽与HLA-A*02:01和HLA-B*40:01的结合强度）显示与MHC-I的肽结合较弱，如NetMHCpan%等级的增加所示（图S1C-F）o对于许多研究的CTL表位，我们检测到多个变异体独立出现在不同的SARS-CoV-2感染个体中（图1A）o为了证实我们深度测序数据集中低频突变的这些发现，我们分析了公共数据库GISAID（33）中超过145,000个可用的全球SARS-CoV-2序列中的固定突变。在0.0000689-7.336%的表位序列中观察到突变（平均值=0.005106%）（

7、图IC）o对于所研究的27个CTL表位，我们发现了10到11,717个具有非同义突变的病毒基因组序列（平均值=807.05）o重要的是，我们在低频分析中发现了GISAID中的固定变体，突出了单个低频突变的相关性（图ID,S1G-S1H）o|FGDDTVIEVFLLPSLATV|tlmnvltlvSMWALIISV|YLQPRTFLLIKLNDLCFTNV|KIADYNYKLKLPDDFTGCV|SIIAYTMSL| LLFNKVTLAALNTLVKQLVLNDILSRLLITGRLQSLRLQSLQTYVRLNEVAKNLNLNESLIDLFIAGLIAIV| FLAFWFLFLFLTWICL

8、| TLACFVLAAV|glmwlsyfi| YLGTGPEAGL|LQLPOGTTL| LALLLLDRLGMSRIGMEVMEVTPSGTWL| KLDDKDPNFc1e-011e-021e-031e-05403020一。DeftaMHCPrecfctanLow-frequencymutatKXisFixed mutationsoLBOO&uonbou:eQ_le-0410400图1在SARS-CoV-2CTL表位中检测到非同义突变。A)在27个CTL表位中检测到的低频突变的等位基因频率。表位显示在右侧。左侧的热图表示由netMHCpan4.1(32)预测的排名百分比变化。大热图下方的条

9、形图将病毒载量表示为Ct值。B)特定表位中突变的等位基因频率。分别描述了两个表位中存在的区域。C)CTL表位中全局固定突变的频率。D)描绘全局固定突变和低频变异之间重叠的维恩图。E)CTL表位的突变在感染后期出现。纵向采样的两名患者的突变频率随时间变化。显示了导致CTL表位中非同义突变的变体。患者1在同一天在某些时间点进行了多次采样。虚线表示调用低频突变的检测限。在查看器中为了检查患者低频表位突变的时间动态，我们使用了来自C0VID-19患者的连续采样的病毒基因组。提示CTL介导的选择压力，病毒表位的突变通常在感染后期出现(比IE)o基于我们对低频和固定突变的分析，我们选择了11种野生型和17

10、种相应的突变肽，预测HLA结合强度降低，用于进一步的生物物理和功能分析(表S3)oCTL表位突变使MHC-I复合物不稳定为了评估非同义突变肽的MHC-I依赖性免疫原性特性，我们用紫外线可裂解肽(UVCP)生产MHC-I复合物，并进行肽交换反应以破坏MHC-IUVCP复合物的稳定性并随后重新组装(义)。我们接下来使用无细胞差示扫描荧光法(DSF)来测量不稳定或重新组装的MHC-I复合物的热稳定性(图2A-E,S%-L)(35-37).如图S1A和S1B所示，HLA-A*02:01-UVCP复合物在暴露于紫外线时会变得不稳定，并且可以通过在紫外线暴露后添加UVCP肽来重新组装。曲线的最小值指定了H

11、LA-肽复合物的解链温度（Tm）。时间远高于37C的值表明在生理温度下肽与MHC-I的强结合，而37C左右的值仅与弱相关，低于36C与缺乏结合相关。对于11种野生型肽中的9种,我们观察到与HLA-A*02:01或HLA-B*40:01的结合，表明这些肽原则上可以由各自的HLA等位基因呈递（图S2C和S2D）o相比之下，11个分析的突变体表现出对MHC-I的稳定能力降低（图2A-E,S2D,S2F-S2L,表S4）o表A-B*40:01限制性MEVTPSTWL肽与重组HLA-B*40:01特异性结合，但不与HLA-A*02:01（4）特异性结合（图2C）,S2L）。弱结合剂的一个例子是突变变体Y

12、FQPRTFLL（而不是YLQPRTFLL），而LFFNKVTLA（而不是LLFNKVTLA）代表HLA-A*02:01的非结合剂（图2A,D）o值得注意的是，对于已发表的CTL表位LQLPQGTTL和LALLLLDRL,我们既没有观察到野生型也没有观察到突变肽与HLA-A*02:01的结合（图S2I和S2L）oBF70GLMWLSYFIGFMWLSYFISARS-CoV-2positive patient PBMCs expandedwith YLQ and GLM wildtype peptidesip、pTemperatureGLMwildtype tetramerYLQwikftype

13、 tetramerGLMmutant tetramerYLQmutant tetramer图2表位变异导致MHC-I结合减少。AE）突变肽MHC-I复合物的热稳定性降低。相对荧光单位（rfu）的负一阶导数随温度升高而绘制。野生型肽的曲线是黑色的，突变的肽是彩色的。曲线的最低点代表肽-MHC-I复合物的解链温度。虚线表示SDon=2-3技术重复。F）具有突变肽的四聚体在37下不稳定。FACS图显示了在4（蓝色）或37（红色）孵育的含有野生型（顶部）或突变型（底部）肽的四聚体染色的体外扩增PBMC的染色。为了进一步证实这些结果，我们生成了载肽的HLA-A*02:01和HLA-B*40:01四聚体，

14、呈现野生型和突变肽,作为从HLA匹配的扩展PBMC中识别同源CD8+T细胞的一种方法COVID-19患者。如图2F所示，当保持在4C时，负载有突变肽的四聚体以依赖于T细胞受体（TCR）的方式染色同源T细胞。然而，当四聚体在使用前在37C下孵育时，T细胞染色被取消，很可能是由于MHC-I的肽丢失和结构解体。总之，这些结果意味着在SARS-CoV-2基因组序列中发现的突变会降低肽-MHC-I的稳定性，随后可能会促进免疫逃避CTL对HLA依赖性识别的识别。研究SARS-CoV-2阳性患者PBMC中的表位反应接下来，我们研究了分离自HLA-来02我1或HLA-来40我1阳性C0VID-19患者的PBM

15、C中的肽特异性CD8细胞反应,图3A、表S5、表S6）o我们首先使用离体ELISpot分析筛选了9种野生型肽，它们在DSF分析中显示出MHC-I结合（表S7）o值得注意的是，5个大流行前健康对照中没有一个对任何肽产生反应。止匕外，我们可以检测到至少一名患者对四种肽的阳性反应，这些肽在其他试验中进行了研究。为此，来自C0VID-19患者和5个大流行前对照的HLA匹配的PBMC用肽刺激并培养10T2天，然后进行四聚体染色（图3B）o这使我们能够确认这些野生型肽是SARS-CoV-2中真正的T细胞表位。我们通过肽介导的再刺激后IFN-y的细胞内细胞因子染色（ICS）进一步证实了病毒特异性CTL反应（图S3A,B）。为了研究病毒表位中已鉴定的突变影响T细胞增殖的程度，我们用负载野生型肽的HLA四聚体对野生型或突变肽扩增的P