2023卵母细胞体外成熟技术发展现状及应用进展.docx

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1、2023卵母细胞体外成熟技术发展现状及应用进展摘要卵母细胞体外成熟(invitromaturationzIVM)技术是一种在体外诱导卵丘-卵母细胞复合物成熟到Mn阶段的技术。为提高未成熟卵母细胞的IVM率，IVM培养系统在发展中不断改进，包括培养方案、培养液的改良及培养环境的优化，并已发展出卵母细胞成熟率高于常规IVM培养方案的双期IVM培养方案，IVM的临床妊娠率也得到了有效改善。IVM因可避免卵巢过度刺激，现已广泛应用于多囊卵巢综合征患者；另也适用于有卵巢储备但对外源性促性腺激素无反应的卵巢抵抗综合征患者；此外，IVM还可与生育力保存技术结合，适用于需进行生育力保存的癌症患者等。本文综述了

2、IVM技术目前的发展现状及应用进展，也为IVM未来方向做一简要概括。【关键词】卵母细胞；体外成熟；多囊卵巢综合征；卵巢抵抗综合征；生育力保存体外受精(invitroferti1ization,IVF)作为辅助生殖技术(assistedreproductivetechno1ogies,ART)中的重要一环，最初是在卵母细胞体外成熟(invitromaturationzIVM)技术的基础上发展而来1-20为提高IVF成功率，临床上常规使用外源性促性腺激素的促排卵方案来增加卵泡的募集以获得多个同时成熟的卵子。但促排卵方案的使用却同时增加了卵巢过度刺激综合征(ovarianhyperstimu1ati

3、onsyndrome,OHSS)2及其他有关卵巢刺激(ovarianstimu1ation,OS)的风险。尤其是在患有多囊卵巢(po1ycysticovarieszPCO)和多囊卵巢综合征(po1ycysticovariansyndrome,PCOS)的不孕或具有卵巢高反应性的患者中，OHSS不仅影响卵子质量，甚至会危及患者生命。近年来随着IVM技术的不断发展,只需低剂量甚至不使用促性腺激素促排卵即可获取未成熟卵母细胞进行IVM培养。因此，IVM技术在临床上越来越受PCOS等易患OHSS风险的患者青睐。然而，有研究报道IVM来源的卵母细胞成熟率低，卵母细胞成熟后行卵胞质内单精子注射(intra

4、cytop1asmicsperminjectionfICSI)后正常受精比例低,形成的胚胎发育潜力较差30此外，也有研究认为IVM来源卵母细胞受精后的囊胚植入和活产率要低于常规IVF方案来源的卵母细胞4,这可能是由于卵母细胞发育的核质成熟不同步所造成50尽管如此，IVM技术已经在临床实践中取得了一系列的进步61本综述针对目前为止IVM技术的研究进展作一简要概述。-.IVM技术简介与发展IVM是一种改良的IVF技术，是指从窦卵泡中获得卵丘-卵母细胞复合体(cumu1usoocytecomp1exes,COCs),在体外通过适当的培养系统将卵母细胞培养至成熟阶段并获得受精能力的方法。IVM技术首次

5、报道于1935年Pincus等7应用兔卵所进行的卵母细胞IVM,接着又报道了使用人卵母细胞进行的IVM8o20世纪60年代，从动物到人卵母细胞IVM,再到未成熟卵母细胞IVM后的成功受精，IVM技术在Edwards的带领下发展迅速90直至1991年Cha等10报道了第1例IVM活产后代，该研究所用卵母细胞来自于未受刺激的被切除的供体卵巢，这一报道在当时引起了学者极大的关注。此后研究者意识到IVM技术可以避免OHSS的发生尤其适合患有PCO和PCOS的不孕患者2o另外对于各种促排卵方案中回收的未成熟卵母细胞进行IVM治疗，可以尽可能减少这部分卵母细胞的浪费。近年来，对于那些没有特定风险、不愿接受

6、激素刺激、在肿瘤治疗前需要紧急进行生育力保存的患者也将IVM技术作为一个重要的备选方案5,11-12o此外/VM技术可以在月经周期的任何时间进行,这也是其具有重要应用价值之处。-.IVM技术及培养体系的优化研究进展1.IVM方案：一直以来，由于IVM的定义未达成统一，临床IVM方案的实施在各个中心也并不相同。根据2023年美国生殖医学协会(AmeriCanSocietyforReproductiveMedicine,ASRM)的最新指南，临床IVM是指患者在未接受或接受最小卵泡刺激素(fo11ic1e-stimu1atinghormone,FSH)刺激(通常处理3d)且不伴或伴有最小人绒毛膜促

7、性腺激素(humanchorionicgonadotropinfhCG)剂量启动(单次10000U注射)后，从卵泡中收集未成熟卵母细胞进行IVM130目前公认的临床IVM方案主要有两种，即常规IVM方案和双期IVM方案140其中常规IVM方案又根据卵母细胞收集前是否接受hCG刺激分为两种：在无hCG的启动方案中，患者通常在无或连续3d的最小FSH刺激后收集未成熟卵母细胞，将未成熟的GV期COCs在体外直接培养至M11期；在使用hCG的启动方案中，患者会在进行卵母细胞采集之前的3638h接受hCG处理2,在这种方案中会收集到MiI期、M1期和GV期的卵母细胞，并且大多数卵母细胞处于GV期。对采集

8、到的M期卵母细胞需要在采集当日进行ICSI授精，而M1期和GV期卵母细胞则需在体外进行IVM,培养成熟后行ICSI授精。双期IVM方案是基于常规IVM方案上的一个改进,是在常规IVM方案基础上增加了pre-IVM的培养步骤，能使未成熟卵母细胞在体外获能，因此也被称为“CAPA-IVM:Pre-IVM培养期间使用C型利钠肽(C-typenatriureticpeptide,CNP)来抑制GV期卵母细胞自发恢复减数分裂，维持卵丘细胞和卵母细胞之间的缝隙连接通讯(gapjunctioncommunication,GJC),促进卵母细胞获得后期的发育能力,14o随后用各COCs移入促进减数分裂恢复的培

9、养基中进行常规IVM培养。在体内，CNP是由卵泡壁层颗粒细胞分泌，其受体NPR2主要表达于卵丘细胞。当CNP与NPR2结合后，卵丘细胞环鸟苜酸(cyc1icguanosinemonophosphate,cGMP)水平增高，cGMP经缝隙连接传递至卵母细胞抑制磷酸二酯酶3A(phosphodiesterase3AzPDE3A)的活性，阻碍环磷腺昔(cyc1icadenosine-31,51-mconophosphate,cAMP)降解，而高水平的CAMP可维持细胞处于减数分裂抑制状态,这有利于促进核质同步成熟和提高卵母细胞发育潜力15-16o有动物实验研究证实，CNP介导的双期IVM方案可以显著

10、提高IVM技术的效率和可行性17-18o因此,这种双期IVM培养方案也在近年来被逐步应用于人IVMo有研究报道表明，采用CNP介导的双期IVM培养方案显著提高了人IVM卵母细胞成熟率和优质囊胚率，特别是对于经最小卵巢刺激后收集获得的小窦卵泡(直径6mm)来源的卵母细胞14,19-20o此外，CNP介导的双期IVM培养方案没有增加囊胚的非整倍体率，且与标准IVM相比,这种方案显著提高了PCOS患者的卵母细胞成熟率和临床妊娠率210但在目前有限的研究中，双期IVM与标准IVM活产率相当21,要确保双期IVM方案的安全性和有效性还需要更广泛的临床研究及随访跟踪。2. IVM培养液的改良：对卵母细胞来

11、说，只有胞核和胞质同步成熟的卵母细胞才具备良好的受精能力及胚胎发育潜能4o而IVM卵母细胞的发育能力下降，主要是由于从小窦卵泡中取出的未成熟卵母细胞会在体外自发核成熟所致，即卵母细胞在体外环境下提前恢复减数分裂导致胞核成熟和胞质成熟的同步性丧失，这是影响IVM卵母细胞来源优质囊胚比率下降的主要因素。这种自发成熟导致GJC的过早断裂，引起一些有益成分如mRNA、蛋白质、基质和营养物质的部分丢失，而这些成分又是成功受精和胚胎发育所必需的220因此，在培养液中进行成分优化也是改善IVM结局的有效途径。首先，培养液成分应极大程度接近体内生理环境，包括保持COCs的结构完整性23和维持减数分裂停滞。因此

12、,向培养液中添加CNP或CAMP水解抑制剂（如IBMX）可有效阻止减数分裂的恢复,并使COC结构得以保留。其次，体内卵泡的生长依赖多种激素的相互作用，因此在IVM培养基中常添加重组FSHxhCG、黄体生成素（1uteinizinghormone,1H1胰岛素和雌二醇等激素中的一种或几种。其中FSH是IVM培养基中最基础的激素补充物，添加浓度范围一般为0.0750.75Um1oFSH主要是通过增加COCs中CAMP的浓度来延缓卵母细胞减数分裂进程以促进卵母细胞核质成熟240虽然也有研究人员习惯联合使用FSH与1H或hCG25-26,但哺乳动物的实验研究结果却认为1H主要是通过作用于壁层颗粒细胞而

13、不是COCs来促进和调节卵母细胞成熟。因此，IVM培养基中添加1H的作用可能并不明显。由于卵泡环境中还存在许多生长因子包括像表皮细胞生长因子（epiderma1growthfactor,EGF）样多肽类生长因子,这些生长因子在体内卵母细胞成熟过程中会发生生理性上调，影响卵丘细胞葡萄糖代谢和卵母细胞线粒体功能。同样地，在体外向IVM培养液中添加EGF样多肽类生长因子会影响COCs代谢，有利于提高卵母细胞成熟率，这一结果已在多种动物以及人的IVM实验中得到证实19,21z27o蛋白质是人IVM培养中必不可少的成分，常见来源包括母体血清、人卵泡液或人血清白蛋白等。由于血清成分复杂，其中含有卵母细胞成

14、熟所必需的生长因子和氨基酸，但也含有许多正常卵泡发育环境中没有的成分，这些成分可能会影响卵母细胞的发育230此外，体外培养过程中的活性氧水平升高引起的氧化应激可导致卵母细胞发育能力降低和细胞凋亡增加，这也是IVM和体外胚胎发育效率低下的主要原因。鉴于此，研究人员针对具有抗氧化特性的化合物在IVM中进行了相关实验27-28o在IVM培养液中添加谷胱甘肽前体、胱氨酸和半胱氨酸等形式的抗氧化剂已被证实可以改善随后的囊胚发育27o有研究显示，添加左旋肉碱（1-肉碱）的IVM培养液提高了小鼠等哺乳动物的卵母细胞发育能力，并能显著提高卵子发育到囊胚阶段的能力271Zou等29的研究显示，在人卵母细胞体外培

15、养过程中添加浓度为10-5mo1/1的褪黑素，可以显著提高GV和M1期卵母细胞成熟率，高质量囊胚率也显著增加，这与低剂量的褪黑素处理可显著减少过量的活性氧和氧化应激对卵母细胞的损害有关。近来，Cao等25的研究首次评估了柳皮素对人卵母细胞的影响，结果显示柳皮素可显著提高IVM成功率,改善受精结局；进一步研究表明，榔皮素可以通过降低与年龄相关的线粒体氧化应激水平、减少凋亡程度和促进自噬来改善衰老卵母细胞的质量。与年龄相关的生育力下降除了与过量的活性氧增加氧化损伤导致卵母细胞成熟不良外，还与非整倍体增加有关。辅酶QW也是一种重要的膜相关抗氧化剂，特别是在抑制脂质过氧化和DNA氧化方面。Ma等30的

16、研究首次证实在IVM培养液中添加50mmo1/1辅酶Q10可显著提高高龄女性卵母细胞成熟率，减数分裂后的非整倍体率也显著下降。3. IVM培养体系的优化：在体内，未成熟卵母细胞是在卵泡内生长成熟,而卵泡具有良好的三维立体结构。所以，研究者们研究采用三维培养系统来尝试进行IVM培养体系的优化。三维培养体系是通过利用胶原蛋白、基质蛋白、纤维蛋白等生物材料为细胞的体外生长提供接近体内生理环境的三维微环境。三维培养系统可根据需要适时调整培养条件，为卵母细胞不同阶段的生长发育提供合适的激素、生长因子、生物信号分子和其他有利于细胞生存的物质，以维持卵泡体外生长发育的良好环境310近年来发展出的海藻酸盐凝胶培养系统已成功应用于人卵泡体外生长，并显著提高了IVM效率32o也有研究认为，IVM培养前，使用三维胶原凝胶（含磷酸二酯酶3抑制剂）对人COCs或裸