无菌动物检测.docx

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1、无菌动物检测无菌动物(germ-free,GF)是指身体任何部位及生活环境中均检测不出任何活的细菌、真菌、病毒及寄生虫的动物1。无菌动物来源于剖腹产和胚胎移植，通过人工饲养，维护在正压无菌隔离器中的动物2。所有的饲料、垫料及水均经灭菌处理，检测无菌后方可传入无菌隔离器内。维持无菌动物需要严格的无菌操作技术和定期的无菌检测。由于不携带任何可检测的微生物，可排除背景微生物对实验结果的干扰,获得高重复性，高敏感度的实验结果。这种动物可以有选择性的接种多菌和单菌，来研究菌种对宿主的作用3。无菌动物不是绝对无菌,而是相对无菌。在现有的无菌检测技术下检测不到任何微生物4。1928年至IJ1980年,Rey

2、niers等5-6与Knight等7证实了哺乳动物、鸟、鱼、昆虫等可在无菌条件下饲养和维持。也是他们建立了第一代无菌大鼠和无菌小鼠。1945年美国圣母大学Lobund实验室的Reyniers等5首次培育出能连续传代的无菌大鼠，接着Gustafsson8也成功培育无菌大鼠。Gilbert等9通过去除动物中不同微生物的方法来研究其与宿主的关系。Kirk10对微生物与宿主的关系做了详细的阐述。微生物的质量控制成为无菌动物培育中至关重要的技术。从过去到现在，细菌、真菌的培养和革兰染色镜检仍然是最常用的方法11-13。但在人工培养基上,由于条件限制，有些微生物不能生长，这就导致了无菌检测结果的不准确。为

3、此有些实验室增加了分子生物学检测技术PCR,利用16S rRNA进行细菌的鉴定，用以弥补上述两种检测方法中的不足13。本文将结合国内外相关文献，对无菌动物无菌检测方法及影响因素进行简要探讨。1微生物培养1.1 采样1.1.1 粪便标本的采集选取无菌隔离器内健康成年无菌大鼠抓取尾巴让粪便自然排出，弃去第一粒粪便。收取第二粒新鲜粪便装于无菌小试管中。按照无菌操作程序从隔离器中传出，并尽快接种完毕,防止在转运过程中细菌死亡。1.1.2 隔离器内环境标本的采集将无菌隔离器内灭菌棉签用无菌水浸湿,擦拭水瓶口、进出通风口、隔离器内壁、笼具表面、动物毛发、手套等。装于无菌小试管中，按照无菌操作程序从隔离器中

4、传出。棉签必须使用高压蒸汽灭菌，干热灭菌会使脱脂棉产生杀菌物质，影响细菌的检出。1.1.3 饲料、垫料及水标本的采集将无菌隔离器内饲料、垫料、水均取适量装于无菌小试管中才安照无菌操作程序从隔离器中传出。1.2 细菌、真菌培养1.2.1 国内无菌动物检测标准污染无菌动物的微生物主要是厌氧菌、需氧菌及真菌，可以通过不同的培养基、不同的培养温度和培养环境对污染菌进行检测。目前我国无菌动物的检测标准主要根据GB/T14926.41-2001实验动物无菌动物生活环境及粪便标本的检测方法，该标准中规定无菌心浸液肉汤(brain heart infusion broth,BHI)、硫乙醇酸钠肉汤(thiog

5、lycollate broth,TB)、大豆蛋白陈肉汤(tryptic soy brothJSB),l种固体培养基血琼脂平板，试剂为无菌生理盐水。标本采集后才妾种脑心浸液肉汤和硫乙醇酸钠肉汤、大豆蛋白陈肉汤增菌培养，放37。(2培养,分别以7、14 d转接血平板并革兰染色镜检。转接血平板后37(培养48 h,观察有无细菌、真菌生长，最终判断是否存在细菌、真菌污染。止匕标准删除了 GB/T 14926.41-1994无特定病原体动物无菌动物生活环境及粪便标本的检测方法中的无特定病原体动物生活环境及粪便标本的检测方法，保留了无动物生活环境及粪便标本的检测方法。增加了硫乙醇酸钠培养基在使用前需煮沸驱

6、氧程序。再从液体培养基转种血琼脂平皿时增加了涂片染色镜检。以防止在转种时细菌死亡而不能在平板培养基生长而造成漏检。GB/T14926.43-2001实验动物细菌学检测、染色法、培养基和试剂，该标准对培养基的配制、分装、高压灭菌条件、储藏条件及使用期限作了规定。1.2.2 国内无菌动物检测的优缺点国内标准对标本采集数量、标本稀释程度、标本存放及接种时间都未做详细规定。检测时未对需氧、厌氧培养进行区分。对培养基的接种管数及阳性对照菌未详细规定。冷藏后培养基需怎样处理后使用未做详细规定。微生物培养方法被认为是有一定局限性的，三种培养基不能培养所有微生物。好多哺乳动物的肠道微生物在实验室里不容易培养，

7、主要缺乏合适的培养基和方法。培养鉴定微生物污染技术较繁琐和困难。严格的厌氧菌培养需要特殊的设备和专业的操作。脑心浸液肉汤适合细菌的增菌培养，大部分需氧菌、兼性厌氧菌都能生长，如粪性链球菌、大肠埃希菌及苛养菌的培养。硫乙醇酸钠肉汤适合需氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌的培养，主要用于厌氧菌的培养。硫乙醇酸盐流体培养基在2000年、2005年及2015年版中国药典中被用作无菌检查培养基，欧洲药典(EP)、日本药典(JP)、英国药典(BP)、美国药典(USP)无菌检查也均采用硫乙醇酸盐流体培养基酒己方一致，用于需气菌、兼性厌氧菌、厌气菌的培养。虽然硫乙醇酸盐流体培养基被各国用作无菌检查，但它自身也存在一定的

8、局限性14:一些苛养菌或强致病菌较难检出;(2)刃天青对微生物有抑制作用、与专门的厌氧菌培养方法如厌氧缸法、厌氧袋(bio-bag )、厌氧手套箱(anaerobieglovebox)、厌氧盒等相比较，其厌氧环境有限。革兰染色镜检也存在各种干扰因素，如饮食中的蔬菜纤维、粪便中的各种物质、食物中留下的死菌。无法鉴别是死菌或活菌,需要培养方法来确认15。革兰染色阳性细菌相对容易检出和观察，而体积较小的革兰阴性球菌则较难观察到。革兰染色镜检的检出限量约109CFU/g粪便16。对于无菌动物来说,污染初期肠道中微生物是比较少的，易受到粪便中的残渣、碎屑等因素的干扰。对于有经验的观察者来说也是非常极具挑

9、战性的，极易造成漏检。总之，革兰染色镜检的确定是对检测灵敏度较低、易造成漏检,优点时即时出结果、速度较快、操作简便、成本较低。1.2.3 中国药典(2015版)无菌检查相较于国内动物无菌检测，中国药典无菌检测方法相对比较全面，但仅适用医药用品。目前,美国、欧盟、日本等国家或组织无菌检查法已协调一致口刀。相比于2010版中国药典,2015版中国药典对无菌检测法的的检测范围及环境要求、培养体系、方法适用性、检查方法等做了进一步完善才妾近国际通用标准。2015版中国药典中规定了无菌检查必须在无菌环境下进行，实验环境必须达到无菌的要求。培养基主要使用硫乙醇酸盐液体培养基和胰酪大豆陈液体培养基。硫乙醇酸

10、盐液体培养基主要用于厌氧菌的培养;胰酪大豆陈液体培养基主要用于PH = （7.3 0.2）接近中性,适用于需氧菌和真菌的培养18-20。药典规定了培养基PH测定的温度应在25。配细培养的温度在2025（和3035。符合了大部分微生物的需求。规定了微生物的培养时间21。规定了培养基的接种管数,对阳性对照菌的选择做了细化。1.2.4 国外无菌动物无菌检测国外无菌检测所使用的培养基各不相同，培养时间和方法也不统一。国外无菌小鼠无菌检测使用培养基有LB培养基（LB）、沙保培养基、脑心浸液（brain heart infusion broth,BHI）、MRS琼脂培养基、ML琼脂培养基22。取1mL标本

11、悬液接种在BHI、MRS、ML、LB培养基37V培养72 h,沙保培养基22P培养3周。标本悬液直接涂片镜检。也有报道使用脑心浸液肉汤（需氧菌培养）、硫乙醇酸钠肉汤（厌氧菌培养）、沙保肉汤（真菌培养）,37（培养1周甚至更长,以防生长缓慢的细菌漏检。血平板和其它非选择性培养基37至少培养5 do推荐接种一份标本于稍低温度培养，比如3CTC或室温，更适合环境微生物的生长15;也有研究推荐增加56P培养23。液体培养基出现浑浊再接种固体培养基培养和显微镜镜检。浑浊可能接种后几天出现,但不一定是细生长,有可能是粪便和其它有机物沉淀。不运动的细菌造成漏检，需要非常有经验的操作者，对食物残渣和细菌进行辨

12、别。（2）细菌染色此法与国内无菌动物检测标准所使用培养基基本一致。有研究使用脑心浸液肉汤、沙保肉汤以及营养肉汤作为无菌检测培养基11,需氧和厌氧两种环境37P培养48h。两种环境下培养设置阴性对照和阳性对照。最好使用厌氧菌来确定无氧环境。国外无菌检测的内容和方法包括:直接涂片镜检法:当无菌动物肠道中有大量细菌繁殖时,未经染色，会对有些比较小和可以利用相差显微镜快速的检测肠道中的细菌,但因为此法细镜检:包括革兰染色镜检、DNA染色法。（3）细菌、真菌培养。（4）分子生物学检测。（5）病毒学检测。（6）寄生虫学检测15。1.2.5 无菌检测培养方法的局限性传统的细菌检测方法，容易培养的是需氧和兼性

13、厌氧菌，只占肠道细菌总量的小部分。比如乳酸杆菌、链球菌、肠球菌和葡萄球菌等。但是严格厌氧菌在肠道细菌中所占的比例极高，每克粪便中含1011个严格厌氧菌。通过培养容易检测的严格厌氧菌的比例约每克粪便106个,甚至更低15。虽然微生物培养是比较敏感的方法，但它有一定的检出限量,当肠道细菌数量少于1001000 CFU/g粪便24,不容易检出。它的污染因素也有很多，比如实验室里常用的细菌的污染;实验室工作人员的皮肤和普通动物粪便的污染;饲料、垫料、器械等高压灭菌不彻底而传进隔离器造成的污染。实验室里细菌的污染通常都是人工培养基上能较好生长的细菌。皮肤上的葡萄球菌和粪便中的大肠杆菌都能在人工培养基上较

14、好生长。微生物培养必须经过严格无菌操作培训的专业人员进行操作，必须在超净台或者生物安全柜中进行，否则出现假阳性的概率还是挺高的。培养的标本量的多少也会影响结果。因此，培养出现阳性结果必须借助其他方法证实其结果的可靠性。2分子生物学技术2.1 采样在无菌正压隔离器中，取新鲜无菌动物粪便和饲料,称量约200 mg于1.5 mL无菌离心管中。按照无菌操作传出隔离器，立即液氮冷冻并转移至80厂冰箱保存，直到DNA提取。2.2 16S rRNA基因测序应用于无菌动物无菌检测目前16S rRNA基因测序是鉴定肠道细菌常用的分子生物学技术。利用16s rRNA分析肠道微生物群至少包括1800个种属和4000

15、0种细菌25。提取哺乳动物新鲜粪便中的DNA,通过细菌通用引物进行PCR扩增，再经16s rRNA基因测序，得到细菌的种类。一般细菌鉴定选择细菌通用引物，最常用的引 物 是27F/1492R。27E5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,1492R:5,-GGTTACCTTGTTACGACTT-3,o 有的文章中会使用不同的通用引物26。有文献提到利用16S rRNA PCR技术证明无菌动物的无菌状态11。RAPD PCR用于鉴定已知定植菌动物的污染15。国外对PCR、qPCR等分子生物学技术在无菌动物和已知菌动物做了详细的比较，结果16S rRNA PCR最适用于无菌动物的检测13。2.3 16S rRNA在无菌动物无菌检测中的优点过去十几年,分子生物学技术在肠道微生物中的应用超过了细菌培养方法。16S rRNA技术因具有快速、高效的特点。相对于细菌培养技术,PCR技术特异性较高,被用于细菌的种属鉴定。16S rRNA能够鉴定难以分类的微生物种类，特别是需要严格厌氧