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1、细胞培养法及荧光抗体检测(I)样品制备:取约25Om1的新生牛血清供试品用于检测,将其配制成含15%供试品的培养液,用于检测全过程的细胞换液及传代。以检测合格的血清作为阴性对照血清。(2)指示细胞制备:至少采用猴源(如Vero细胞)、以及2种牛源细胞(BT和MDBK细胞或无病毒污染的原代牛肾细胞)以及人二倍体细胞作为指示细胞。细胞复苏后至少传代一次后使用。根据所需量制备足够量的细胞。(3)用含有供试品的培养液将4种指示细胞分别接种于75cm2细胞培养瓶中,接种量应使细胞在培养7天后可达到至少8090%汇合。同时制备阴性对照血清培养瓶。将培养瓶置37、5%Co2培养箱中培养至少7天。可在第5天时
2、换液一次。(4)第7天进行第1次盲传,将接种供试品及阴性对照的每种指示细胞培养瓶分别传出至少2个75cm2培养瓶,继续培养至第14天,在第12天时可换液一次。(5)在第13天时(或笫2次传代前1天)或阴性对照瓶细胞达到至少70%汇合时,制备阳性对照用细胞。即取1个阴性对照细胞瓶分别传至6孔板或其它适宜的细胞板中用于细胞病变观察(CPE).血吸附检查(HAd)及荧光抗体检测(IF),次日接种阳性对照病毒。(6)第14天时进行笫2次盲传。将第1次传代后的细胞培养物分别传至6孔板或其它适宜的细胞板中,进行细胞病变观察及HAd检查时,接种于每种指示细胞上的待测样本至少接种3孔;进行荧光抗体检测时,接种
3、于每种指示细胞上的待测样本进行每种病毒检测时至少接种2孔。继续培养至少至第21天。剩余细胞样本-60或以下保存备用。(7)在第14天接种阳性对照病毒:取(5)制备的指示细胞接种适量阳性对照病毒,置361C、5%C02培养箱吸附2小时,吸弃上清液,加入适量细胞维持液,置361C、5%Co2培养箱培养7天。对于BT细胞,BVDV可作为病变阳性对照,BPI3可作为HAd阳性对照,牛副流感病毒3型(PI3)、牛腺病毒(BAV-3)、牛细小病毒(BPV)以及牛腹泻病毒(BVDV)、为IF检测阳性对照;对于MDBK细胞,呼肠孤病毒3型(RE03)和PI3可分别作为细胞病变及HAd检查阳性对照,P13、BA
4、V-3、BVDVsREo-3为IF检测阳性对照;对于Vero细胞,PI3可作为细胞病变及HAd检查阳性对照,PI3及RE0-3作为IF检测阳性对照。可不设立狂犬病病毒(RabieS)阳性对照。所有IF检测阳性对照病毒应接种IoO-300Ce1D50。(8)接种阴性对照及供试品的细胞培养物在接种后每日观察细胞病变情况,在接种后至少21天或末次传代后至少7天时分别进行病变观察、HAd检查及IF检测。阳性对照培养物在接种后第7天或10%细胞出现CPE时可进行IF检测。进行血吸附检查时,用鸡与豚鼠血红细胞在28C及2025C进行检测。进行荧光抗体检测时,将细胞固定后采用直接或间接免疫荧光抗体检查法,至
5、少应对BVDV、P13、BAV-3、BPV、REo3以及RabieS进行检查,结果均应为阴性。(9)结果判定:阴性对照应无细胞病变,血吸附检查应为阴性,荧光抗体检测应为阴性;阳性对照应有明显的细胞病变,血吸附检查应为阳性,荧光抗体检测应为阳性,判为试验成立。供试品如无细胞病变,血吸附检查为阴性,且荧光抗体检测为阴性,判定为符合要求。待测样本如出现细胞病变,或血吸附检查为阳性,或任何一种荧光抗体为阳性,则判定为不符合要求。经病毒灭活处理的牛血清,灭活前取样检测后若任何一项检测显示为阳性,不建议用于生产。除非可鉴别出污染的病毒,且病毒灭活工艺验证研究显示其污染量可被有效灭活时方可使用。如果灭活前BVDV病毒检测为阳性,灭活后还应取样采用敏感的方法检测BVDV,结果阴性为符合要求。未经病毒灭活处理的牛血清用于生产,若任何一项检测显示为阳性,则不得使用。不能用感染试验检测的牛源性病毒也可采用核酸检测法,但应采用大量样品提取核酸(如25至50m1的血清样本),并计算检测合并血清的最低检出限水平。