2023淋巴瘤基因重排检测技术及解读中国专家共识（最全版）.docx

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1、2023淋巴瘤基因重排检测技术及解读中国专家共识（最全版）摘要淋巴瘤是我国常见的恶性肿瘤之一，诊断难度较大。目前淋巴瘤的诊断主要基于细胞形态学（ce11morpho1ogy）、细胞免疫学（ce11u1arimmuno1ogy细胞遗传学（cytogenetics）和分子生物学（mo1ecu1arbio1ogy）4大类检查。其中，分子检测是诊断淋巴瘤尤其是疑难病例的重要手段。基于肿瘤组织的所有细胞均来源于同一个癌变细胞这一理论基础，我们可以利用细胞克隆性分析来辅助进行淋巴细胞恶性肿瘤的诊断。由于99%B细胞淋巴瘤和94%T细胞淋巴瘤分别伴有免疫球蛋白基因和T细胞受体基因的克隆性重排，因此免疫球蛋白

2、基因或T细胞受体基因克隆性重排的分子检测可作为克隆性分析的方法之一。淋巴瘤基因重排检测技术及解读中国专家共识（2023版）编写组结合临床实践经验，主要基于临床常用的聚合酶链反应技术对淋巴瘤基因重排相关工作原理、方法及手段进行了相关阐述，以进一步指导与规范我国淋巴瘤基因重排检测工作的进行。正文淋巴瘤主要发生在淋巴器官和淋巴组织，可分为霍奇金淋巴瘤（H1）和非霍奇金淋巴瘤（NH1）两类，临床表现为恶性程度高，发展迅速，预后差。我国2023年H1新增病例6829例，死亡2807例；NH1新增92834例,死亡54351例。NH1依据细胞类型不同分为T细胞NH1（占10%20%）和B细胞NH1（占80

3、%以上工既往我国的多中心数据研究中指出：H1患者占所有淋巴瘤病例的构成比为8.54%,NH1在所有淋巴瘤病例的构成比为87.69%,B细胞NH1与T/NK细胞淋巴瘤的构成比例约为3：1。淋巴瘤诊疗规范（2018年版）指出，免疫球蛋白（Ig）/T细胞受体（TCR）基因重排分别是B、T淋巴细胞的主要特征，可用于协助鉴别淋巴细胞增殖的单克隆性与多克隆性，以及鉴别无法通过免疫组织化学（IHC）诊断的淋巴瘤，是对形态学和IHC检查的重要补充。2023年中国淋巴瘤治疗指南也明确指出淋巴瘤中抗原受体基因的克隆性重排对于精确诊断疾病、指导规范治疗必不可少。一、淋巴瘤病理诊断中的ISE检测原理淋巴细胞的Ig和T

4、CR的基因结构是由可变区（V）、连接区（JX多变区（D）及恒定区（C）组成，基因重排在淋巴细胞发育过程中发挥着重要作用。在淋巴细胞早期发育时,B细胞中的Ig基因和T细胞中的TCR基因发生特定J1质序的重排，形成V-（D）-J片段，使每个淋巴细胞都有独特的重排形式，这保证了正常免疫反应中抗原受体的多样性。但当淋巴瘤发生时，人体就会失去对某个基因重排细胞的控制，该细胞就会出现不可控制性、单克隆性的增生。恶性肿瘤的所有细胞都具有共同的克隆起源，因此淋巴细胞克隆性的评估可以支持淋巴系统恶性肿瘤的诊断结果。同时有5%10%的淋巴恶曲中瘤病例诊断较为复杂，需要通过Ig和TCR基因克隆性彝林佥测来辅助诊断。

5、1 .基因重排的模式（1）B淋巴细胞中Ig基因由2条相同的重跳IgH）和2条相同的轻链（IgVIg入）构成。重链的V区由V、D、J片段编码，而轻链的V区由V和J片段编码。每个B淋巴细胞可以表达多种类型的重链，但只能表达1种轻链即Ig域Igo在基因重排的过程中，首先是IgH基因中D和J基因片段重排形成D-J基因片段,接下来V基因片段与D-J基因片段重排形成V-D-J基因片段；随后IgK中的V和J基因片段开始重排形成功能性的IgKB;若这一步未构建出功能性的Ig,B细胞则启动下一步程序：IgAS因的V和J基因片段重排，形成Ig入链。（2）在T淋巴细胞中，存在4种TCR蛋白单体分别为（TCRA（TC

6、RB）、（TCRG）和b（TCRD）蛋白，它们可以形成2种亚型的TCR即TCRY济口TCRo每条TCR链也经历了类似Ig的重排方式。TCR的重排过程从TCRD基因中的D-J和V-DJ重排开始,然后是TCRG基因中的V-J重排，其目的是构建合适的TCRY浚体；当无法构建时，T细胞中的TCRB基因将继续进行D-J和V-DJ重排，最后是TCRA（V-J重组）重排，从而构建出TCRa受体。2 .重排检测的体系建立：目前主流的克隆性重排检测方法是采用聚合酶链反应（PCR）法，它是利用合适的引物与基因片段结合，通过扩增以及对产物的分析才佥测出Ig/TCR基因的重排状态；其优点是速度快、所需DNA质量低、灵

7、敏度高。当前淋巴瘤基因重排检测技术是基于BI0MED-2体系建立起来的。该体系目前已被临床广泛接受和认可，成为淋巴瘤重排检测的金标准。BIOMED-2体系设计包括VH-JH、DH-JH、IgIgATCR仅TCR丫、TCR6、bd-1-Ig和bd-2-IgH等多组引物，同时利用异源双链分析或基因扫描分析对PCR产物进行分析，检测其是否存在克隆性重排。利用基因扫描法可达到0.5%1.0%克隆淋巴细胞的灵每嬷，快速且简单,比异源双链分析更加灵敏。BI0MED-2体系基本可以覆盖所有B细胞和T细胞克隆性重排状态，对于微小残留病变的检测也适用。二、病理应用与临床意义1 .鉴别增生淋巴细胞的良恶性:基因重

8、排结果呈多克隆性通常提示为淋巴细胞反应性增生，而单克隆性则通常提示为肿瘤性增生。这一特性可以用于辅助鉴别淋巴细胞增生的良恶性，同时也可以用于检测治疗后的微小残留病灶。需要注意的是，检测结果显示单克隆性，并不代表一定是肿瘤，一些良性或病毒感染性病变也可以表现出单克隆性增生，因此，病理诊断需要结合形态和免疫表型综合评判。2 .鉴别肿瘤T/B谱系：对于确诊为淋巴瘤的样本，可以利用淋巴瘤基因重排来明确肿瘤细胞的谱系来源；检测到Ig基因重排通常提示为B细胞淋巴瘤，检测到TCR基因重排则通常提示为T细胞淋巴瘤。但需要注意的是，Ig和TCR基因重排并不是B细胞和T细胞所特有的，部分肿瘤仍有跨谱系重排的发生。

9、3 .辅助鉴别淋巴细胞的克隆性关系：Ig/TCR基因重排检测能够辅助明确复发肿瘤与原发肿瘤的克隆性关系；如果两者重排模式相同，则考虑复发肿瘤与原发肿瘤存在克隆性相关性；如果重排模式不同，则认为复发肿瘤为第二原发。三、样本类型及处理1 .样本的前处理:针对送检的样本病理科需进行准确有效的前处理如固定、脱水等，方能保证后续检测的精准进行。针对整体前处理流程需注意以下几个问题：(1)针对临床送检的经手术切除的淋巴结组织病理科接收标本后需在剖开后进行固定。常规淋巴结最大径不超过1.5Cm时对半分开即可，如出现肿大或体积较大的淋巴结时应保证切开后的淋巴结厚度不超过0.3cm,同时尽量剔除周围脂肪组织。(

10、2)送检的待测组织整体固定时间(取材前固定+脱水机固定)不得超过30h0(3)组织进入脱水机后，脱水机的固定温度不得超过37,时间不得超过3ho同时脱水机内相应的脱水液温度不得超过37,石蜡温度不得超过62oCe(4)在节假日等非工作日，脱水组织可分别停留在95%n、100%工、100%乙醇中。2 .不同类型样本的处理方式：(1)石蜡包埋组织样本：建议样本离体30min内及时取材固定，采用3.7%中性甲醛溶液固定，通常固定液是组织体积的10倍。一般室温下活检样本固定612h,手术样本固定1248h,大样本应切开充分固定。由于保存环境及保存时间会导致DNA片段化，建议石蜡组织18-25保存,原则

11、上使用3年以内的石蜡组织进行检测，以保证提取样本DNA的质量。（2）新鲜组织样本：新鲜样本可提取高质量的核酸，建议离体30min内提取DNA,防止核酸降解。（3）骨髓穿刺及活检样本：骨髓和骨髓液均可以进行Ig/TCR基因检测，骨髓液采集量以35m1为宜,可在采集后室温下2h内直接提取DNA,如不能及时提取DNA,可制成蜡块以待后续检测。骨髓组织一般穿刺长度为152.0cm,直径约2mm,不建议使用强酸脱钙，且脱钙时间不宜过长,以免破坏样本DNAo（4）体液样本：外周血采集量35m1为宜，首选EDTA抗凝剂，禁止使用肝素抗凝，推荐72h内4OC保存运输，如不能在此时间内提取DNA,建议-80OC

12、保存，避免反复冻融；其他常见的体液样本,如脑脊液、胸腔积液、腹腔积液、玻璃体液等，可在采集后室温下2h内离心取沉淀细胞，直接提取DNA,或4OC保存运输，24h内提取DNAo如不能及时提取DNA,应-80。（:保存,也可制成细胞蜡块以备后续检测。相应样本保存和操作条件也可参考其他共识。四、DNA制备与质控1. DNA的制备：所有待检测组织学和细胞学标本需制备HE切片，外周血及其他体液标本有条件可制作细胞涂片染色，经病理医师质控，评估肿瘤类型、细胞含量、坏死率等，筛选适合淋巴瘤重排检测的组织学类型，样本的肿瘤细胞比例应20%,并确保有足量的肿瘤细胞提取DNA,必要时可根据HE切片或涂片标记肿瘤细

13、胞区域进行富集。对于石蜡组织样本如切片厚度按34m计算，手术大标本（一般组织大小1cm1cm）5张白片，活检穿刺小标本15张白片，如提供白片较厚可相应减少白片数量，或23个57m的蜡膜（取自无明显组织坏死,出血，纤维结缔组织的组织样本）血液等体液标本应采集足够量的体积以满足DNA提取的需要。根据样本类型的不同，选取对应的DNA提取试剂，外周血样本及蜡块采用针对各自DNA的专用提取试剂。提取的DNA可4OC保存一周，-80OC长期保存，避免反复冻融。2. DNA质量控制：DNA的质量对检测结果的准确性有重要影响,需要从DNA纯度、DNA浓度以及DNA片段化程度进行充分评估。一般采用紫外分光光度法

14、测定DNA的纯度和浓度,A260/A280比值在1.82.0之间的DNA纯度最佳。DNA提取后应及时进行浓度测定，浓度过高或过低的标本，建议适当稀释或浓缩DNA溶液。同时可通过琼脂糖电泳或毛细管电泳检测所提取DNA的片段大小情况，检测所需的重排目的片段200-400bp最佳。对于不符合检测要求的样本,易出现假阳性（假克隆或寡克隆）或假阴性结果，建议根据具体情况，更换不同蜡块组织或重新送检其他类型的待测样本，必要时需重新采集样本。五、检测及PCR标准化流程1.淋巴瘤基因重排检测有以下几种方法C）Southernb1ot印迹杂交法：将待测DNA样本固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，洗涤游

15、离探针后用发射自显影等技术，显示待测的片段及相对大小。步骤繁琐,费时,需要大量新鲜或冷冻组织，同时有放射性同位素污染,灵敏度较低，制约了该方法在临床中的应用。(2)PCR加聚丙烯胺凝胶电泳法：设计多重引物对待测样本进行PCR扩增反应，扩增出待测样本的PCR产物经聚丙烯胺凝胶电泳,显示出待测片段及相对大小。PCR操作步骤简便,快速，对样本量要求降低，但需要每次配制凝胶，染色剂演化乙锭等对人体有害，结果需紫外光观察，分辨率低,约20bp,容易误判。(3)PCR加毛细管电泳基因扫描法：在多重引物上标记荧光基团，使PCR扩增的产物引入荧光信号，经毛细管电泳仪时激发荧光，仪器收集荧光信号，通过计算机软件

16、自动处理和计算分析数据。操作简单,检测速度快,检测结果直观易懂，分辨率高达1bp,诊断准确率高，在临床实际工作中广泛应用。2.淋巴瘤基因重排检测的PCR标准化流程：淋巴瘤基因重排PCR标准化流程主要包括以下步骤：(1)样本采集和DNA提取：具体要求前文已述,注意避免样本间交叉污染。(2)扩增体系配制：试剂配制应在试剂准备区进行，优先使用国家药品监督管理局认证的试剂，视各实验室具体情况采用经性能确认的实验室自建方法(IabOratOry-deve1opedtest,1DT)的试齐上无论哪种试剂耗材，在使用前都应进行质检和验证，并保存相应记录。(3)加待测样本DNA:此步骤应在样本制备区进行，根据不同的PCR反应体系的要求在配制好的PCR扩增体系中加入适量的待测样本DNA,同批次实验中应设立阳性对照、阴性对照及空白对照，对检测体系、操作过程及待测样本检测有效性等进行监测。(4)PCR扩增：此步骤应在扩增区进行，对PCR扩增要使