牛乳及其制品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的测定 液相色谱法.docx

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1、ICS65.120CCSX04NY中华人民共和国农业行业标准NYTXXXXX-XXXX牛乳及其制品中3乳白蛋白和B-乳球蛋白的测定高效液相色谱法Determinationof-1acta1buminand-1actog1obu1ininmi1kanddairyproducts-Highperformance1iquidchromatography点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）（本稿完成日期：2023.07）XXXX-XX-XX实施XXXX-XX-XX发布中华人民共和国农业农村部发布4.1刖百本文件按照GB/T1.12023标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则

2、的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。本文件由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口。本文件起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）、内蒙古智慧质量中心有限公司、黑龙江飞鹤乳业有限公司。本文件主要起草人：XXXo牛乳及其制品中-乳白蛋白和B-乳球蛋白的测定高效液相色谱法1范围本文件描述了牛乳及其制品中-乳白蛋白和-乳球蛋白测定的高效液相色谱方法。本文件第一法适用于生牛乳和巴氏杀菌牛乳中a乳白蛋白和P.

3、乳球蛋白的测定；第二法适用于高温杀菌牛乳、灭菌牛乳、牛乳粉和牛乳基婴幼儿配方乳粉中乳白蛋白和P-乳球蛋白的测定。本文件生牛乳和巴氏杀菌牛乳中-乳白蛋白定量限为25mgkg,P-乳球蛋白定量限为IOOmg/kg；高温杀菌牛乳和灭菌牛乳中-乳白蛋白定量限为50mgkg,。-乳球蛋白定量限为IOOmg7kg；牛乳粉中-乳白蛋白定量限为250mg/kg,代乳球蛋白定量限为500mg/kgo注：本文件仅适用于未变性的-乳白蛋白和B.乳球蛋白的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其

4、最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。第一法反相液相色谱法4原理试样用水溶解调节PH至4.60,使酪蛋白和变性的乳清蛋白沉淀，未变性的-乳白蛋白和-乳球蛋白仍保留在溶液中，离心后经反相色谱柱分离，高效液相色谱测定，外标法定量。5试剂或材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂。5. 1水，GB/T6682,一级。5.2 三氟乙酸：色谱纯。5.3 乙酸：优级纯。5.4 乙懵：色谱纯。5.5 三氨乙酸溶液（0.1%）：准确移取Im1三氟乙酸（5.2）,用水定容至11,混匀，现用现配。5.6 三氟乙酸乙懵溶液（0.1

5、%）：准确移取1m1三氟乙酸（5.2）,用乙懵（5.4）定容至11,混匀，临用现配。5.7 混合标准储备溶液（Iomgm1）:准确称取-乳白蛋白标准品（CAS号：9051-29-0,纯度299,5%）和P乳球蛋白标准品（CAS号：9045-23-2,纯度297.2%）各IOomg（精确至0.0Img）于IOm1容量瓶中，用水稀释并定容，混匀。于-20。C以下保存，有效期3个月。5.8 混合标准中间溶液（200mg1）:准确移取混合标准储备溶液（5.7）2001,用水稀释并定容至10m1,混匀。临用现配。5.9 混合标准系列溶液：准确移取一定量的混合标准中间溶液（5.8）,用水稀释定容，配置成浓

6、度分别为ImgZ1、5mg110mg1520mg1,50mg/1、IoOmgz1和200mg/1混合标准系列溶液,现用现配。5. 10微孔滤膜：水系，0.22m06仪器设备5.1 液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。6. 2天平：精度0.1mg和0.01mg。6.3旋涡混合器。6. 4离心机：转速不低于12000r/min。6.5pHif：精度为0.01。7样品取生牛乳、巴氏杀菌牛乳约200g,混匀，装入洁净容器中，立即测定。8试验步骤8.1 提取平行做两份试验。称取试样5g（精确到0.1mg）于50m1离心管中，加适量水混匀，用乙酸调节PH为4.600.05后，转移至容量瓶中用水定容

7、至25.0m1,混匀，转移至离心管中，静置IOmin以上，12000转min,离心IOmin。准确移取上清液1m1于5m1容量瓶中，用水定容，混匀，过膜（5.10）为试样溶液，待测。8.2 测定步骤8.2.1反相液相色谱参考条件反相液相色谱参考条件如下：a）色谱柱：C4色谱柱（300A）,柱长250mm,内径4.6mm,粒径3.5m,或性能相当者。b）检测波长：21Onm；c）流速：1.5m1min;d）柱温：60；e）进样量：301;f）流动相：A：三氨乙酸溶液（5.2）,B：三氨乙酸乙月青溶液（5.3）；梯度洗脱条件见表1。表1梯度洗脱条件时间minA%B%09556.5623810623

8、812406015406015.595520.09558.2.2测定8.2.2.1标准系列溶液和试样溶液测定在仪器的最佳条件下，分别取混合标准系列溶液（5.6）和试样溶液（8.1）上机测定。乳白蛋白和供乳球蛋白标准溶液的液相色谱图见附录A,P-乳球蛋白有P-乳球蛋白A和P.乳球蛋白B两个峰。8.2.2.2 定性以保留时间定性，试样溶液中-乳白蛋白和0-乳球蛋白保留时间应分别与混合标准系列溶液（浓度相当）中-乳白蛋白和-乳球蛋白的保留时间一致，其相对偏差在2.5%之内。8.2.2.3 定量分别以a-乳白蛋白和-乳球蛋白的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标（其中-乳球蛋白以-乳球蛋白A和-乳球蛋臼B

9、峰面积之和计），绘制标准曲线，其相关系数应不低于0.99。试样溶液中待测物的浓度应在标准曲线的线性范围内。如超出范围，应将试样溶液用水稀释后，重新测定。9试验数据处理试样中a乳白蛋白或乳球蛋白的含量以必计，单位为毫克每千克（mgkg）,按式（1）计算:(1)pV3V110Q0nm21000式中：P被测组分曲线计算浓度，单位为亳克每升（mg/1）；%上机液定容体积，单位为毫升（m1）；Vi试样处理液体积，单位为毫升（m1）；in试样质量，单位为克（g）;V2吸取上清液体积，单位为亳升（m1）；IOOO换算系数；超出曲线范围后的稀释倍数。测定结果以平行测定的算术平均值表示，计算结果保留三位有效数字

10、。10精密度在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10%。第二法凝胶渗透色谱法11原理试样用水溶解调节PH至4.60,使酪蛋白和变性的乳清蛋白沉淀，未变性的乳白蛋白和P.乳球蛋白仍保留在溶液中。溶液中加入盐酸胭和P-疏基乙醇，以盐酸脏为变性剂，以-筑基乙醇为还原剂，断开蛋白质中的硫硫（SS）化学键，形成展开的*乳白蛋白和P乳球蛋白的单体结构。经凝胶色谱柱分离，高效液相色谱测定，外标法定量。12试剂或材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂。12. 1水：GB/T6682,一级。12.2 盐酸（HC1）:取414.49m1的浓盐酸（含量36.0%-38.0%）,用水稀释定容至

11、500m1.12.3 。-臻基乙醇（C2H6OS）。12.4 氢氧化钠溶液（500g/1）：称取250g氢氧化钠，加入适量水溶解，冷却至室温，定容至500m1,混匀。12.5 磷酸盐缓冲溶液：称取56.6g磷酸氢二钠、3.5g磷酸二氧钠和2.9g乙二胺四乙酸，将其溶解到80Om1水中，用氢氧化钠溶液（12.4）或盐酸（12.2）将PH值调节到7.50.1。将溶液转移至I1容量瓶，用水定容至刻度，临用现配。12.6 盐酸胭缓冲溶液:称取573g盐酸胭,置于IOoom1烧杯中,添加IOOm1磷酸盐缓冲溶液（12.5）,再用水将该溶液稀释到约900m1,同时不停搅拌，用氢氧化钠溶液（12.4）调节P

12、H值到7.50.1。将溶液转移至I1容量瓶中，用水定容至刻度，过微孔漉膜（12.9）。12.7 混合标准储备溶液（10mg/m1）：准确称取-乳白蛋白标准品（CAS号：9051-29-0,纯度299,5%）和B-乳球蛋白标准品（CAS号：9045-23-2,纯度297.2%）各IOonIg（精确至0.01mg）于IOn11容量瓶中，用水稀释并定容，混匀。于-20C以下保存，有效期3个月。12.8 混合标准系列溶液：准确移取混合标准储备溶液（12.7）,用盐酸胭缓冲液（12.6）稀释并定容至10m1,配制成浓度分别为5.0Ing/1、20.0mg/1、80.0mg1.150.0mg/1、300.

13、0mg/1和600.0mg/1的标准系列溶液，混匀。分别取1.5m1标准工作溶液，加入101B-臻基乙醇（12.3）,剧烈震荡1min,室温静置2h后上机测定。12. 9微孔滤膜：水系，0.22m013仪器设备13.1液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。13. 2天平：精度0.1mg和0.01mg。13. 3离心机：转速不低于12000r/min。13.4 PH计：精度为0.01。13.5 涡旋混合器。14样品14.1 高温杀菌牛乳、灭菌牛乳：取高温杀菌牛乳、灭菌牛乳约200g,混匀，装入洁净容器中，立即测定。14.2 牛乳粉、牛乳基婴幼儿配方乳粉：取牛乳粉、牛乳基婴幼儿配方乳粉约20

14、0g,混匀，装入洁净容器中，常温密闭保存。15.1 提取15.1.1 高温杀菌牛乳、灭菌牛乳平行做两份试验。称取试样12.5g（精确至U0.1mg）到烧杯中，加适量水混匀，用盐酸（12.2）调节PH至4.600.05,转移至容量瓶中加水定容至25m1,混匀，转移至离心管中，静置2h,12000转离心IOmin。准确移取上清液Im1于5m1容量瓶中，加入盐酸胭缓冲液（12.6）3m1,再加入50a1P-疏基乙醇（12.3）,用盐酸服缓冲液（12.6）定容，混匀，室温静置2h,摇匀后过膜（12.9）为试样溶液，待测。15.1.2 牛乳粉、牛乳基婴幼儿配方乳粉平行做两份试验。称取试样2.5g（精确至

15、UO.Img）到离心管中，加适量水混匀，用盐酸（12.2）调节PH至4.600.05,转移至容量瓶中加水定容至25m1,混匀，转移至离心管中，静置2h,12000转Zmin,离心Iomin。准确移取上清液Im1于5m1容量瓶中，加入盐酸心缓冲液（12.6）3m1,再加入501p疏基乙静（12.3）,用盐酸脏缓冲液（12.6）定容，混匀，室温静置2h,摇匀后过膜（12.9）为试样溶液，待测。15.2 测定步骤15.2.1 色谱参考条件凝胶渗透色谱参考条件如下：a）凝胶渗透色谱柱：二静基亲水硅胶柱，柱长300mm,内径4.6mm,粒径2m,或性能相当者。b）检测波长：280nm。c）流速：0.18m1mind）柱温：室温。e）进样量：1010f）流动相：盐酸肌;缓冲溶液（12.6）。15.2.2 测定15.2.2.1 标准系列溶液和试样溶液测定在仪器的最佳