最新：卵胞质内单精子注射（ICSI）技术中国专家共识（2023年）.docx

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1、最新：卵胞质内单精子注射(ICS1)技术中国专家共识(2023年)摘要人类卵胞质内单精子注射(intracytop1asmicsperminjection,ICSI)技术开展至今已有30余年。其最初主要应用于针对严重少、弱、畸形精子症导致的男性不育患者的治疗，但随着未成熟卵体外培养、卵子冷冻、胚胎植入前遗传学检测等辅助生殖技术的开展，ICSI使用比例已大幅提升。虽然目前ICSI技术相对成熟，但仍有很多细节值得关注和完善。为规范与优化人类辅助生殖技术从业者的ICS1操作，由中国医师协会生殖医学专业委员会发起，并联合全国多家生殖医学中心共同编撰了本共识。20世纪90年代首例卵胞质内单精子注射(in

2、tracytop1asmicsperminjection,ICSI)婴儿的诞生1,标志着对男性不育的治疗取得了突破性进展。如今该技术已常规应用于全球各生殖中心，并且随着未成熟卵体外成熟培养(invitromaturation,IVM),卵子冷冻、胚胎植入前遗传学检测(preimp1antationgenetictesting,PGT)等辅助生殖技术(assistedreproductivetechno1ogy,ART)的广泛开展，ICSI的使用比例也大幅增加2。因此，能够熟练、高效、安全地进行ICS1操作是每一个胚胎学家应具备的基本技能。虽然ICSI技术比较成熟，基本流程也具有较高的标准化，但

3、仍有部分细节值得关注或有待完善。本共识将从ICSI的适应证、正常及常见异常形态卵子、卵子的显微注射、受精观察、ICS1特殊情况的应对及其他细节、ICS1技术的质控及培训等几个方面进行阐述并提出相应推荐意见，旨在为人类ART实验室从业者提供实用性参考，从而为广大不孕患者提供更高质量的服务。-.ICSI的适应证虽然ICSI技术成功解决了一些严重男性因素导致的不孕问题，但在部分非男性因素不孕的治疗方面，其有效性和安全性仍不明确3-4o因此，ICS1技术的使用需更加谨慎。1 .男性因素：极重度少精子症及弱精子症，即精子浓度1106/m1及精子前向运动百分率1%,处理后的前向运动精子总数不足100万5-

4、6。对于授精方式的选择，目前国内外尚无明确的精子参数阈值，应结合前向运动精子总数、精子形态及病史(不育年限、原发/继发不育等)进行综合考虑。特殊类型畸形精子症，如圆头精子症、大头精子症、无头精子症及精子鞭毛多发形态异常。ICS1是治疗圆头精子症的主要方法，而其他特殊类型畸形精子症建议先行遗传学筛查，明确致病基因后再选择辅助生殖助孕方式7o手术取精，指通过附睾或睾丸手术取精且无论新鲜或冷冻保存8。精子功能异常，即精子中缺乏精子特异性卵子激活因子(sperm-borneoocyteactivationfactorzSoAF)导致卵子激活障碍，目前认为磷脂酶C蛋白(phospho1ipasesCze

5、ta,P1C)是主要的SOAF9o射精功能障碍，如逆行射精且出现精子浓度或活力严重下降10。精子免疫性因素，即抗精子抗体阳性导致精子活力下降、发生特异性凝集、影响精子与卵子透明带的结合及顶体反应11。2 .非男性因素：需行PGT周期12:IVM周期12;卵子冻融周期12;不明原因前次常规IVF周期完全受精失败12;前次周期卵子普遍存在透明带异常(如锯齿样/蜡样透明带)13-14o推荐意见：应将ICS1作为上述男性与非男性因素的唯一或首选授精方式。对于常规IVF授精有污染史且未能抗菌治愈的病例，仍然存在再次IVF授精污染风险，可尝试选择ICSI15-16o而对于不明原因不孕、高龄及获卵数较低等因

6、素，尚无证据表明ICS1可提高活产率12,因此推荐短时受精结合早补救技术。另外，虽然ICS1仍为PGT周期的推荐授精方式17,但目前对于单纯为了避免父源DNA对检测结果产生干扰而行ICS1尚存争议18-19z因此也有共识建议PGT周期中，ICS1应仅限于精子污染可能对检测结果准确性造成影响的情况下应用12o二 .ICSI周期中正常及常见异常形态卵子通常情况下，仅对出现第一极体(firstpo1arbody,Pb1)的核成熟卵子进行ICSI授精。评估卵子质量的形态学结构包括：卵丘-卵母细胞复合物(cumu1us-oocytecomp1exes,COCs)、Pb1、透明带、卵胞质以及卵周间隙(pe

7、nvite11inespace,PVS)o理想形态的卵子应该具有：近似椭圆且完整的Pb1;厚度适中、折光无异常且边缘规则的透明带；颗粒感均匀适中且不含任何内容物的细胞质；大小正常且无颗粒/碎片弥散的卵周间隙。在卵丘细胞去除后，60%70%的卵子表现出异常的形态学特征20,但卵子形态对胚胎发育潜能的预测仍存在不同的结论21-22o本共识整理了正常及常见异常形态的卵子以作参考，详见图1oS1人类正1及南电“南哪/A示COC（成熟卵f.卵丘川胞松敢.甯实所示为PM）：H示COC（未成熟卵f.耶丘川胞彼格.未她PbI）;C示（XMX退化部/41透明俯破？m示正常影毒即：E示Ia霰光M做镜F正意形套期f

8、.访懂体箭头所小）位JIR体正下方+示Y哪r；（；示（；卵f出示*质粗幅.鞭依愿明Mr1均匀：1示总由“她洞面内质网殷.Jft似网盘:J示*质多发春泡（早凹暗修.最大空泡直径的I6tun.新去所示）;K小也Hi缰*35*集，中央区域（粒WWM;1示异常ZP.5琼脂图归无PVS*丽出现折光体篇头所示,为SI*m）;M示异常ZP.边除V修俳状.”，IYj1牙状S/所示.JCPVS;N示，增忸20m为增母）;。示ZP希色.透明度下即篇去所示卵不）;P示PVS增大（至少可以容纳2个正常大小的1*1Q示ZP夹瓜（箭头所示）；H示PVS内大MwI粒髀片;S示巨大IIM（K径为卸w;T示方Pb1n较大;I示

9、PM碎片化I”，VS增大:、示连体mRW示电麒不现剜；X示【，大卵。葡失所示.总体平均自径妁”0.*哦华均在校为1501n）.取Pb1.*砥/*器*集：、示KU网影口大卵干推荐意见：COC中卵丘细胞的致密度与卵子成熟度呈负相关，成熟度越低则卵丘细胞越致密，越不容易观察到卵子；巨大卵子（卵子直径200m,胞质直径150m）应予以丢弃；GV卵子和巨大极体卵子（长径40m）应根据成熟或正常卵子的比例，酌情选择丢弃；M1卵子根据患者实际情况决定继续体外培养或丢弃（见五、ICSI特殊情况的应对及其他细节);滑面内质网簇(smoothendop1asmicreticu1umc1uster,SERc)x大空

10、泡(直径14m)或多发小空泡、胞质细胞器聚集、锯齿或蜡样透明带以及多重异常形态卵子会对受精、胚胎发育及妊娠结局产生较大的负面影响，但部分卵子通过ICSI仍然可以获得健康活产婴儿，因此建议这部分卵子进行特殊标记并不作为移植首选。三 .卵子的显微注射1 .显微操作系统：显微操作系统是ICSI操作的基础设备，主要由倒置显微镜、X-Y-Z轴驱动系统、油压/气压显微注射仪、恒温加热板及防震系统组成，不同品牌操作系统之间有所差异，但基本结构及工作原理相似。推荐意见：显微操作系统应安置在百级净化区域(ISOC1ass5),该区域应相对独立、安静且人员流动较小，远离门口和传递窗口，尽量避免高效滤器出风口直吹操

11、作台面和操作人员，这样可以保障操作环境稳定，使操作人员免受外界因素干扰而更加专注23。除此之外，与显微操作相关的培养箱应尽量靠近显微操作设备，增加操作流程的顺畅度，减少配子或胚胎在外界暴露的时间。2 .ICS1操作皿的制备：ICSI操作皿通常由用于卵子注射的HEPES/MOPS操作液微滴和加注精液样本的聚乙烯口比咯烷酮(po1yviny1pyrro1idone,PVP)液微滴所组成。ICSI操作皿应至少提前2h置于37不通气培养箱中进行温度平衡24。建议使用通过鼠胚试验和内毒素检测的ICSI专用皿。推荐意见：ICS1操作皿各类微滴的具体布局没有统一标准，可根据个人操作习惯制备，但应遵循如下基本

12、原则及参考技巧24:操作液微滴应尽量集中于皿的中部，以避免操作针下降时触碰皿的侧壁；如果是极重度少、弱精或睾丸/附睾精子，也可不用制作PVP微滴，直接将精子悬液制成微滴；建议双人制皿，及时覆盖培养油，避免因挥发而改变液滴渗透压。3 .显微操作针的安装：用于ICS1的显微操作针包括注射针和持卵针。通常厂商会根据不同内外径尺寸、针尖形状、前端角度等提供多种规格的显微操作针，一般认为采用内径更小、尖端更长的注射针有助于降低卵子的退化率25,有研究表明使用内径35m的注射针行ICSIr较使用内径57m的注射针可使卵子退化率下降7%左右26。显微操作针的正确安装对于ICSI操作至关重要。推荐意见：安装时

13、避免注射针内产生大量气泡：操作针在插入持针器过程中如遇到较大阻力时切勿强行插入，应检查持针器管路内是否有破损的玻璃残留物；若发现操作针吹吸不顺畅，尤其是无法稳定控制注射针内的精子时,应首先检查装针位置和水晶螺母松紧度；当确保装针到位并拧紧水晶螺母后上述问题仍未解决，应考虑是水晶螺母内的密封胶垫出现了老化或破损，需及时进行更换；将安装好的操作针在低倍物镜（4或IOX）下进行调焦，并使注射针和持卵针成一条直线；注射针前端角度并非与皿底完全平行，但角度不宜过大，以成功压停运动精子的最小角度为佳。4 .卵子的脱颗粒：ICSI前需将COCs的大部分或全部颗粒细胞剥离，以便于卵子成熟度和形态的评估及后续的

14、显微注射。脱颗粒过程采用透明质酸酶消化和机械吹吸相结合的方式。基本步骤：COCs在透明质酸酶中剥离大部分的卵丘细胞，随后在含HEPES或MOPS的配子缓冲液中用剥卵管进一步去除透明带外层的放射冠。推荐意见：建议卵子在透明质酸酶中作用的时间30s24o脱颗粒的总时间控制在12min内，因此不建议一次操作过多的卵子（58枚为宜）27。建议使用口径（内径）递减的烧拉制成的玻璃吸管或商品化剥卵针逐步进行卵子脱颗粒：通常先用管口烧制光滑的巴斯德吸管在酶中进行吹吸消化、随后用内径200m左右的吸管转移至干净配子缓冲液中、然后用内径160180m的吸管/拨卵针进行粗拆、最后用内径135140m的吸管/拨卵针

15、将颗粒细胞剥离干净27;脱颗粒后的卵子应进行充分洗涤，最后移入卵裂培养液中孵育至少1h24。5 .显微注射基本步骤：精子制动、调整穿刺位置并固定卵子、穿刺透明带及胞质、负压破膜、注入精子（图2）,操作过程力求简练、轻柔、缓慢。注:假I圈小精干的位置:箭头东箭子移动方向;Pb1小第,极体:Pvp小聚乙始毗格烧用图2M总注射过程（200X）A示轻乐精WE部中段或下段进行M动;B示调整PM位置并网定卵户.小尖抵住透明带Vi将脑广移到针尖处;C示突破透明带并朝人腮质.但此时并未破黑:D示当胞质瞬时通人针内时（破腹）.即刻终止负压:卜:小精子进入电质.应避免注入PP推荐意见：将精子注入胞质内是受精的关键

16、。精子头颈部顺利滑出针尖，并且撒针后不随胞膜的回弹而持续后移，即标志着精子成功注入胞质。当观察到破膜成功，但精子在注入时明显受阻而依然停留在针尖内侧，并且在撒针后精子会沿穿刺通道缓慢向外移动，表明回吐的胞膜褶皱阻碍了精子的进入23如遇此种情况,可以进行二次回吸胞质，然后再重新注入精子；或者平行于第一次穿刺通道位置进行二次穿刺，重新破膜后再注入精子。经过第一次穿刺拉伸后的胞膜，通常在二次穿刺时仅需轻微负压甚至无需负压即可破膜23。推荐在200-400X放大倍数下进行精子的制动和卵子的注射。6 .精子的制动：精子制动的主要目的是止动。与此同时精子质膜被破坏，导致核周膜暴露并促进卵子激活因子的释放2