荧光标记mRNA差异显示技术知识点梳理汇总.docx
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1、荧光标记mRNA差异显示技术mRNA差异显示技术(differentia1disp1ay,DD)是用于研究基因的差异表达的新方法。该技术自1992年被首次报道后,即以其不可替代的优势被广泛应用于生物医学领域。在应用过程中不断得到改进,并产生了诸多衍生技术如RPA(RNAfingerprintingbyarbitrariIyprimedPCR)、GDD(genomicDD)等。本文简要介绍在本试验室荧光标记差异显示技术(f1uorescentDD,FDD)的应用及体会。1 .材料与方法1.1 标本人单核细胞系U937,细胞密度2X1071,分对照组(N)、处理I组(T1)、处理组(T2),N用1
2、640培养基及10%胎牛血清培养,T1用IFN-104U11PS1Ug1T2用IFN-10U/11PS10g/1分别刺激7h.1.2主要试剂与仪器TR1ZO1试剂(GIBCOBRD、F1uoroDD试剂盒(Genomyx)、Supersript逆转录酶(GIBCOBRD、Amp1iTaqDNA聚合酶(GIBCOBRD、RNase-freeDNaseI(Promega);Genomyx1R、GenomyxSCnDNATherma1Cyc1er(PerkinE1mer)1.3总RNA的制备按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总RNA,以RNase-freeDNaseI(终浓度80000U/1)除去
3、其中污染的DNA,经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性,并以紫外分光光度计检测其纯度1.4mRNA差异显示1.4.1逆转录反应选择锚定引物T7(dT12)AP(anchoredprimers,P),序列为5ACGACTCACTATAGGGCTTTTTMN3,其中M=AGCN=A/G/C/T,以总RNA为模板进行逆转录反应,每管反应体系如下:总RNA1.0g,AP4pmo1,705min,加入50mmo1/1Tris-HC1(pH8.3),75mmo1/1KC1,3mmo1/1MgC12,IOmmo1/1DTT,25mo11,dNTPmix(1I1I1I1),SuperScriptII60UnitS,
4、总反应体系201,425min,5050min,7015min01.4.2荧光标记差异显示PCR选取与逆转录引物序列相同的带荧光物质标记的锚定引物TMR-T7(di2)AP,随机引物(5,Acaatttcacacaggaacgctagttg3),以逆转录产物为模板,进行PCR反应。反应体系包括:20mmo1/1Tris-HC1(pH8.4),50mmo1/1KC1,3.75mmo1/1MgC12,逆转录产物3.01,50mo1/1dNTPmix(1:1:1),0.35mo115-随机引物,0.35mo1/13-锚定引物,Amp1iTaq0.5Units,总反应体系101o反应步骤如下:952m
5、in;9415s,5030s,722min,4个循环;9415s,6030s,722min,个循环;72延伸7min01.4.3分离差异显示片段配制5.6%变性聚丙烯酰胺凝胶,胶厚0.25mm,大小61X33cm。将PCR产物加401上样缓冲液,95变性后上样。3000V.IOOW.55电泳4.5ho干胶后置于GenomyXSC扫描,用系统所带的ACqUireSCPrOgrain软件分析处理扫描结果。1.4.4回收差异条带用AcquireSC软件将差异条带定位,用一次性手术刀片切割下所需条带,置于30UI去离子水中,37水浴30-60min,备用。1.4.5差异条带的再扩增以经上述处理的回收条
6、带为模板,T7启动子22Fier(5,GTAATACGACTCACTATAGGGC3,)、反M13(-48)24-mer(5,AGCGGATAACATTTCACACAGGA3,)为引物,进行再扩增反应:模板2.01,20mmo1/1Tris-HC1(pH8.4),50mmo1/1KC1,1.5mmo1/1MgC12,20mo11dNTPmix(1I1I1I1),0.2Umo1/1T7、0.2mo1/1M13-rAmp1iTaq1.0Units,总反应体系20U1.反应条件同差异显示PCR02.结果2.1总RNA的质量总RNA经DnaseI处理,用1.0%甲醛变性凝胶电泳,可见清楚的28S、18
7、S、5S条带,且28S/18S约为2:1(图1),表明RNA完整性好,无降解现象。N、TKT2的0D260/0D280比值分别为192、1.831.98,表明样品纯度高。Fig.1Resu1toftota1RNAonforma1dehyde-agarosege12.2荧光标记mRNA差异显示结果显示每一泳道均有约50条大小不等的扩增产物,各组间比较见较多呈有无或强弱变化的差异条带,图2中箭头所示。Fig.2Ana1ysisofgeneexpressionofce11streatedwithIFNand1PSbydifferentia1disp1aytechnique2.3差异条带再扩增取T2中
8、约1.25Kb的条带再扩增,结果见图3.Fig.3Reamp1ificationresu1tofdifferentia11yexpressedbandDNAmarkeris200bp1adder(200bp2kb),1.Okbisarrowed3.讨论基因表达是调节细胞生物学行为的核心。探讨处于不同生理、病理状态下的有机体之间的未知表达基因的差异,是研究生命本质的有效途径。1992年报道的真核细胞mRNA差异显示技术,为检测未知的表达基因提供了一种新的途径。DD技术具有快速、敏感、可同时检测两组或以上的组织或细胞、RNA用量少、可检测某一表达基因的有无或其表达的强弱等优点,一经问世即受到许多领
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