BVDV中和抗体检测SOP.docx

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1、BVDV中和抗体检测SOP编号：S0P-Z1013-00页码：14版本号：01修订号：00机密等级：秘密起草人起草日期颁发部门质量管理部审核人审核日期批准人批准日期生效日期分发清单研发部质量管理部综合管理部生产管理部市场销售部财务部1. 目的建立血清BVDV中和抗体检验操作规程，以确保抗体水平检测效果。2. 适用范围初制、精制血清的BVDV中和抗体检验操作。3. 职责3.1. 质量管理部：负责本规程的起草。3. 2.QC：负责本程序的操作。4. 3.总经理：负责本规程的审批。5. 定义无6. 引用标准中华人民共和国兽药典2010版7. 材料及设备8. 1试剂9. 1.1.标准毒株OregOnC

2、14V9.1. 2,标准阳性血清、标准阴性血清6.1.3.犊牛原代肾细胞、睾丸细胞和牛肾细胞系（MBDK）细胞。62实验器材9.2. 1.微量细胞培养板（简称微量板）96孔平底板。62.2,加样器：1001单通道和多通道的可调加样器。9.2.3. 相应的吸尖62.4.培养基6.2.5.稀释液及营养液（DMEM或MEM），pH7.07.2,每毫升加100g链霉素和IOOIU青霉素,按说明书配制。6. 2.6.生长液：营养液加10%犊牛血清。7. 2.7.维持液：营养液加2%5%犊牛血清。8. 2.8.细胞消化液：EDTA-胰酶9. 2.9.被检血清：常规分离血清，56灭活30位11。10. 流程

3、图无11. 内容8.1定量试验8.1.1.血清稀释8.1.1.1.用多通道加样器于96孔微量板中每孔加稀释液501o8.1.1.2.用单通道加样器取501灭活的被检血清加于微量板的第一排孔中，每份样品加4个孔。8.1.1.3,用多通道加样器（调至50H1）从第一排孔开始作连续倍比稀释，直至最后一个孔，并从最后孔中弃去50U1稀释物。8.1.2.加病毒8.1.2.1.用稀释液将标准毒株0regonC24V稀释成含100TCID50/501的工作液。8.1.2.2.用多通道加样器从第二排孔开始每孔加病毒工作液501,第一排孔中加501稀释液作为被检血清对照。8.1.3. 将微量板盖严，置于37C5

4、%二氧化碳培养箱中中和2小时。8.1.4. 将细胞悬液（参照细胞传代操作规程）100H1加到微量板各孔中，或将生长成良好单层的细胞用EDTA一胰酶消化液消化分散后，用生长液配制成含40万m1的细胞悬液加到微量板的各孔中，每孔1001o8.1.5. 试验需作下列对照：8.1.6.阳性血清对照：2倍稀释血清501+501病毒工作液+1001细胞悬液。8.1.7.阴性血清对照：2倍稀释血清501+501病毒工作液十100U1细胞悬液。8.1.8. 正常细胞对照：细胞悬液IOOU1+维持液1001o8.1.9. 病毒用量滴定：将病毒工作液用稀释液作三次10倍递进稀释取：8.1.10. 1.9.1.病毒

5、工作液IoOTCID50/50U1：501+稀释液501+细胞悬液IoOH1；8.1.9.2.IOT病毒工作液10TCID50/501：501+稀释液501+细胞悬液1001；8.1.9.3.102病毒工作液1TCID50/50U1：50u1+稀释液50U1+细胞悬液100U1；8.1.9.4.103病毒工作液0TCID50/501：501+稀释液50H1+细胞悬液10018.1.9.5.以上各对照均作4个孔。8.2. 定性试验8.2.1. 用多通道加样器于96孔微量板中每孔加稀释液5018.2.2,用单通道加样器取501灭活的被检血清加到微量板与血清编号相应的孔中，混匀后弃掉501,每份血清

6、作4个孔。8.2.3.病毒工作液稀释方法同8.12.1。8.2.4,用多通道加样器将病毒工作液加到微量板的各孔中，每孔501o8.2.5.以下操作按8.12.8.1.4进行8.2.6.试验后第4天开始观察结果，并于第6天作终判。8.3.结果判定8.3.1.当细胞对照孔内细胞单层生长良好，病毒用量在50TC1D50501500TC1D501范围之内，阳性血清对照孔不出现细胞病变，阴性血清对照孔出现细胞病变，证明试验成立，可以进行结果判定，否则，试验不成立，应重作。8.3.2.判定标准8. 3.2.1.定量试验：每份血清同一稀释度的4个孔中有两个孔完全被保护，不出现细胞病变（CPE）时，该稀释度倒数即为该血清的抗体滴度。9. 3.2.2,定性试验：被检血清在1:5稀释时有2个或2个以上孔的细胞被完全保护，该血清即为阳性。10. 注意事项10.1. 严格按照GMP要求规范操作，以防止检定结果不成立。9.2.注意不得混淆不同名称和批号供试品9.3.使用的计量器具应经过计量校验9. 4出现超标结果，应在试验记录中如实记录。9.5出现OOS情况，应及时报告主管。参见质量检验超出标准调查分析程序，完成OOS记录。10. 附录及派生记录无I1相关文件11.1.质量检验超出标准调查分析程序12.修订记录修订号修改内容生效日期