云岭牛第5部分：体外胚胎生产.docx

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1、ICS 65.020.30CCS B43H53云 南 省 地 方 标 准DB53/T 447.52022代替DB53/T 447.5-2012云岭牛 第5部分：体外胚胎生产2022 - XX - XX 发布2022 - XX - XX 实施云南省市场监督管理局发布DB53/T 447. 52022本文件按照GB/T 1. 1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件为DB53/T 447-2022云岭牛的第5部分。DB53/T 447已经发布了以下部分：第1部分：品种；第2部分：养殖场建设规范；第3部分：人工授精；一一第4部分：胚胎移植；一一第5部分：体外胚

2、胎生产；第6部分：饲养管理；第7部分：饲草加工与调制技术；第8部分：育肥技术；一一第9部分：疫病防治；一一第10部分：档案管理；第11部分：胴体生产、评定及分割技术。本文件代替DB53/T 447. 5-2012BMY牛第5部分:体外胚胎生产，与DB53/T 447.5-2012相比，除结构调整和编辑性改动以外，主要技术变化如下：a）更改标准名称为“云岭牛；b）更改全文“BMY牛”为“云岭牛”；c）“术语”中增加了英文名称（见第3章）；d）更改了 “主要器具、耗材”中部分表述（见4.3）；e）更改了 “采卵装置和器具”中部分表述（见6. 1. 1. 1）,删除“酒精棉球”（见2012版6. 1

3、. 1. 1）；f）更改了 “采卵”中部分表述（见6. 1.2）；g）更改了 “采卵频率”中部分表述（见6.1. 3）；h）更改了 “主要材料”表述顺序（见6.2. 1）；i）更改了 “卵巢的收集”中部分表述（见6.2.3）；j）更改了 “卵母细胞的检出”中部分表述（7. 1）；k）更改了 “卵母细胞的分级”中部分表述（见7.2.1）；1）更改了 “受精卵的清洗和体外发育培养”中部分表述（见10.2. 1、10.2.2）。本文件由云南省草地动物科学研究院提出。本文件由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。本文件起草单位：云南省草地动物科学研究院。本文件主要起草人：和占星、黄必志、王安

4、奎、金显栋、刘建勇、张继才、黄梅芬、王吉吉、亏开兴、杨世平、赵刚、杨凯、袁希平、杨寿军。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为： 2012年首次发布； 本次为第一次修订。DB53/T 447-2022云岭牛是以2014年12月国家审定新品种“云岭牛”为载体制定的综合养殖标准，旨在从品种、养殖场建设、繁殖、管理、饲草加工调制、育肥、疫病、档案和胴体评定分割等方面指导和规范云岭牛的养殖，带动云岭牛规范化、标准化、产业化发展的同时，可提高养殖场（户）养殖水平和养殖效益，促进云南肉牛产业高质量发展。DB53/T447-2022由H-一个部分构成。 第1部分：品种。目的在于确立云岭牛特征和特性、生产性

5、能、种牛等级和良种登记，适用于云岭牛品种鉴定和种牛等级评定。一一第2部分：养殖场建设规范。目的在于确立云岭牛选址、规划与布局、牛舍建设和辅助设施建设等技术要求。 第3部分：人工授精。目的在于确立云岭牛种公牛选择、母牛的初配年龄与发情鉴定、输精方法、母牛妊娠诊断等技术要求。一一第4部分：胚胎移植。目的在于确立云岭牛快速扩繁受体牛同期发情、供体牛超数排卵与输精、胚胎回收、胚胎质量鉴定、胚胎冷冻保存与解冻、胚胎移植、受体牛妊娠诊断等技术要求。 第5部分：体外胚胎生产。目的在于确立云岭牛供体牛的选择与饲养管理、卵母细胞的获取、卵母细胞的检出与分级、卵母细胞的IVM、卵母细胞的IVF、受精卵的IVC等技

6、术要求。一一第6部分：饲养管理。目的在于确立云岭牛饲养管理的基本要求以及牛场卫生、各类牛的饲养管理等技术要求。 第7部分：饲草加工与调制技术。目的在于确立云岭牛养殖过程中青贮饲料、秸秆氨（碱）化饲料、青干草饲料的加工调制技术要求。 第8部分：育肥技术。目的在于确立云岭牛优质牛肉生产和雪花牛肉生产技术要求。一一第9部分：疫病防治。目的在于确立云岭牛的生物安全、牛场消毒、疫病防治及无害化处理等技术要求。 第10部分：档案管理。目的在于确立云岭牛养殖过程中建档范围、内容及档案管理的技术要求。 第11部分：胴体生产、评定及分割技术。目的在于确立云岭牛胴体生产、评定、分割以及分割肉包装等技术要求。DB5

7、3/T 447-2022包含的十一部分内容均是符合生产实际需要，涵盖了生产环节中的品种、养殖场建设、繁殖、饲养管理、饲草加工调制、育肥、疫病防治、档案管理和胴体生产、评定及分割多方面技术。该标准可规范云岭牛从养殖场到牛肉产品的全系列生产技术，充分发挥云岭牛生产性能，提高养殖水平，促进规模化标准化养殖的构建和肉牛产业的发展。#DB53/T 447. 52022云岭牛第5部分：体外胚胎生产1范围本文件规定了云岭牛供体的选择与饲养管理、卵母细胞的获取、卵母细胞的检出与分级、卵母细胞的IVM、卵母细胞的IVF、受精卵的IVC等技术要求。本文件适用于牛体外胚胎生产和移植技术操作。2规范性引用文件下列文件

8、中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB53/T 447云岭牛第4部分：胚胎移植3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1活体采卵ovum pick up借助超声波探测器或内窥镜，直接从供体牛活体卵巢中采集（吸取）未成熟的卵母细胞。3.2体外受精 in vitro fertilization在体外培养条件下完成卵母细胞的成熟、受精、以及受精卵发育成可移植胚胎。其过程包括卵母细胞的体外成熟（历历次。maturation, IVM）、体外受精（In vi

9、tro fertilization, IVF）和受精卵的体外发育培养（In vitro culture, IVC）。3.3体外胚胎生产 in vitro embryo production以IVM、IVF和IVC连续步骤生产胚胎的过程，称为体外胚胎生产embryo production, I VP） o4设施、仪器及器具、耗材3.4 主要设施胚胎工程实验室、采卵室、分牛栏、保定架等。3.5 主要仪器超净工作台、超纯水仪、高压灭菌仪、干热灭菌仪、E0灭菌仪、超低温冰箱、电冰箱、电子天平、倒置显微镜、实体显微镜、CO2培养箱、活体采卵装置、胚胎冷冻仪、恒温台、水浴锅、细胞（胚胎）培养运输仪、液氮罐

10、、pH测定仪、封口机等。4. 3主要器具、耗材DB53/T 447. 52022硅化瓶、烧杯、量筒、过滤灭菌滤器（0.22 pum, 0. 45 pn）、酒精灯、离心管（10 mL或15 mL、50mL）、培养皿、注射器（1mL、5mL、10mL、20mL、50mL）、检卵器或微细玻璃管、巴氏玻璃管、记号笔、计时器；过滤式集卵（胚）杯、手术器具一套（毛剪、止血钳、镶子等）、塑料细管专用剪、塑料细管（0.25 mL）、胚胎解冻杯和温度计、胚胎移植枪、移植枪加外套和保护膜、75%酒精棉球等。5供体牛的选择与饲养管理供体牛的选择参照DB53/T 447. 4的规定执行。供体牛的饲养管理参照DB53/

11、T 447. 4的规定执行。6卵母细胞的获取6. 1获取方式从活体供体牛卵巢中采集（活体采卵）或从屠宰后母牛离体卵巢中采集卵母细胞。6.2活体采卵（OPU）1.1 .1采卵前的准备1.2 . 1.1装置和器具B型超声波扫描仪、扇形阴道探头（7.5MHz）、真空泵和恒温器；16G、17G、18G金属采卵针、回收管、50 mL离心管（集收杯）、一次性注射器（5向八10 mL）等。6. 2. 1.2麻醉剂2%利多卡因或普鲁卡因。6.2. 1.3采卵液D-PBS+ 10 lU/mL肝素钠+1% FCS+青霉素 100 IU /mL+ 100 pg/mL链霉素。6. 2.1.4采卵装置的调试将采卵装置按

12、要求安装好，并调试到正常工作状态，同时把采卵液及其它必需物品在专用台车或工作台上摆放好。6.2. 1.5供体牛的保定与麻醉按DB53/ T 447. 4的规定执行。6. 2. 2采卵按以下步喉采卵：a）用右手将B超探头轻缓地插入母牛阴道子宫颈一侧的穹隆处，并把握好；b）左手插入直肠，用手隔着直肠壁找到卵巢，并将其贴近探头面上，通过B超显示屏观察卵巢是否正常，记录卵泡的数目及其大小；c）将吸满采卵液的单腔采卵针插入装在探头上的采卵针筒中；d）用直肠中的左手移动卵巢使穿刺目标卵泡位于B超显示屏中显示的采卵线上，根据B超显示屏上所显示的目标卵泡位置，用把握探头的右手手指推动进针管进行穿刺（针头刺穿阴

13、道壁和卵泡壁）的同时踩下脚踏开关将卵母细胞及卵泡液一同吸到置于恒温器中收集管内（37K恒温）；e）穿刺目标卵泡为直径2 mm8 mm；f） 吸卵时真空泵压力80 nmiHg85 mm IIgo6. 2.3采卵频率根据实际需要可采用每周1次2次、每月一次或在母牛集中配种前随机选择，批量采卵。6. 3从屠宰后母牛离体卵巢中采集卵母细胞7. 3. 1主要材料保温箱（壶）、止血钳、手术剪、乳胶手套、注射器、针头、离心管、注射器用灭菌过滤器（0.25pm）等。8. 3.2卵巢保存液灭菌的PBS液或生理盐水+100 mg硫酸卡那霉素。9. 3.3卵巢的收集母牛屠宰后30min内采集卵巢，用卵巢保存液冲洗2

14、次3次后放入盛有33。（：保存液的保温瓶内保存,尽快带回实验室。10. 3.4卵母细胞的吸取按以下步骤进行卵母细胞的吸取：a）以PBS液100 mL+青霉素100万单位、链霉素10 mg,过滤灭菌配置采卵液，装瓶后放入33的恒温槽内待用；b）清理卵巢上粘着的脂肪等组织，用保存液冲洗2次3次，放入加有卵母细胞清洗液（含量0.3%BSA的B0液（见9.1.1）的烧杯后暂置入33久恒温槽内；c）用带18G或20G针头的10 mL注射器吸取2 mm8 mm卵泡的卵泡液，注入到15 mL或50 mL离心管内置于恒温槽待检卵和分类。7卵母细胞的检出与分级11. 1卵母细胞的检出按以下步骤检出卵母细胞：a）

15、收集到的卵泡液倒入胚胎滤杯中，用含5%10%CS或FCS的PBS液的洗卵液稀释，洗涤3次4次，将滤杯中的液体及沉淀物倒入培养皿中；b）在实体显微镜下检出卵母细胞，如使用带有侧滤网的胚胎滤杯，则可直接在其中检卵；c）收集卵质色泽基本均匀、卵母细胞周围有1层数层卵丘的卵丘-卵母细胞复合体（Cumulusoocyte complexes, COCs）放入盛有PBS液的培养皿中。7.2卵母细胞的分级与选用7. 2. 1卵母细胞质色泽均匀，卵母细胞周围包围24层卵丘细胞，卵丘-卵母细胞复合体（The cumulusoocytes complexes, COCs）完整为【级。7. 2.2卵母细胞质色泽均匀、卵母细胞周围包围3层卵丘细胞，COCs完整为H级。7. 2.3卵母细胞质色泽基本均匀、卵母细胞周围包围12层卵丘细胞，COCs基本完整为III级。