中药川芎中川芎嗪提取工艺优化的研究.docx

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1、摘要I第1章引言2第2章实验方法32.1 色谱分析方法32.1.1 标准品配制及标准曲线绘制32.1.2 精密度实验42.1.3 重复性实验42.2 提取溶剂的选择52.3 提取溶剂浓度的选择52.4 提取次数的选择52.5 提取液料比的选择62.6 川苟嗪提取工艺的优化62.7 验证性实验6第3章实验结果与讨论73.1 不同提取溶剂的提取效果比较73.2 不同乙醇浓度的提取效果比较73.3 不同提取次数效果比较83.4 不同液料比提取效果比较83.5 正交实验结果9结论1112致谢错误!未定义书签。中药川苜中川苜嗪提取工艺优化的研究摘要本课题目的在于研究川萼中川萼嗪的提取工艺，以寻找优化其工

2、艺的最佳提取方式。通过开展单因素考察实验，探索可能影响川苛嗪提取效果的各种因素。建立在以往资料基础上，设定乙醇浓度依次为20%、40%、60%、80%和100%,在相同体积下，研究了不同乙醇浓度对川苜嗪提取率的影响。实验结果显示，浓度为60%、80%和100%三个浓度的乙醇对川苜嗪的提取率显现出较好效果，且差异不大，该实验结果为后续的正交试验建立了实验基础。此外，又选择了不同时间下的提取及实验次数,制作提取4次，提取的时间分别为1.5h、1.Oh、0.5h0.5ho最后，完成了单因素的试验，以此为基础，通过正交试验明确并选择了川可嗪的最优提取工艺。关键词：川苜；川茸嗪；提取工艺第1章引言川萼嗪

3、能够保护心、脑等重要脏器受到缺血灌注损害的作用，其抗心肌缺血反流的机制体现在多个方面，如保护线粒体、吸收氧自由基、抗凋亡、抗凋亡等，抑制脂质过氧化，促进能量代谢，抑制钙超载，维持钙稳态等。在上述作用机制的基础上,发挥着维持人体不同脏器正常生理功能的目的口川。在对川苜嗪的既往药理学研究中，存在众多抗血栓、抗缺血损伤的案例。川可嗪还能抗凝血，降低血液总粘度。其机制主要是通过调节血小板、淋巴细胞和红细胞中CXCR4的表达水平叫除上面所述外，川耳嗪还可以延缓和抑制血管平滑肌细胞的增殖，扩张血管，保护血管内皮细胞。心脏的病理状态常表现心肌收缩、心肌细胞活性差、心肌肥大等现象。川茸嗪可以调节和改善心脏的生

4、理功能，能够发挥抑制收缩、保护细胞的作用。家兔心室肌的钙瞬变和收缩实验显示，无论是否存在异丙肾上腺素的作用，川苜嗪给药后，均可抑制心室肌细胞1型钙通道的钙内流。川尊嗪对心脏有支持作用，还对大脑损害也有许多种支持保护作用，其主要是通过抗氧化，清除氧自由基等多种渠道，通过减轻氧化应激损伤，降低细胞外雌激素液中无自由基羟基和多巴胺的代谢含量，保持人体内多巴胺总水平，增加Idopa作用时间。肝纤维化是肝脏最常见的病理状态。川尊嗪能够通过多种途径改善肝脏纤维化的进程和程度，由此来实现对肝损害的保护治疗作用。川苜嗪抗肝纤维化是通过限制肝星状细胞的繁殖，促进肝蛋白酶的表达，降低细胞外基质网。根据国外有关报道

5、，川茸嗪可改善三七诱发的小鼠肝静脉阻塞性疾病叫亦能够阻滞和延缓大鼠肝硬化的发展进程，通过降低大鼠IePtin、TGF-1的表达水平。川苗嗪对肾脏也有很好的保护作用，主要通过延缓肾细胞的衰老、抗氧化，清除氧自由基的方式来降低肾功能损伤和肾纤维化的形成。川苜嗪能降低血清肌酎、尿素氮和24小时尿蛋白，延缓小鼠的早期慢性肾功能不全和后期小鼠慢性肾衰发病的进程。与此同时，还能够增加HIF-(X和VEGF的蛋白表达以及肾小管间质微血管的增殖10O川萼嗪能限制肝癌细胞、肺癌细胞、黑色素瘤细胞的无限增殖。川萼嗪还可以切断肿瘤细胞的繁殖周期，从而使肿瘤细胞自我消亡，自我吞噬，增强人体对癌细胞侵袭的抵抗力，大大降

6、低了癌细胞的耐药性，提高免疫功能等多种有效方法发挥临床治疗作用W1研究显示，处于兴奋时期的大鼠经给予川茸嗪后，其状态变的安静，这说明川茸嗪能够起到镇静催眠的效果。此外，根据现代药理研究表明较大剂量川萼嗪和安全剂量下的戊巴比妥钠合用对小鼠有更好的催眠效果，并且还延长同剂量下戊巴比妥钠对小鼠的镇静催眠的时间,121o近年来对于川尊嗪提取方法的研究表明，中药川萼中川芽嗪的提取在各大研究实验室、工厂都采用的是简单乙醇提取，酸碱处理的方法，但是它们都由于提取时间过长,所耗经费过高各种原因被排除在工业化生产之外，不能进行大规模的生产。所以，为了能大规模生产，提高经济效益。科研工作者对提川苜嗪提取工艺优化进

7、行了大量的科研实验，根据赵莉恋g对于川苜嗪研究的结果为评价依据，对川茸嗪的提取工艺优化进行了大量的科研实验，众多结果显示，用80%的乙醇来提取川苜嗪，第一可提取2小时，第二次可提取1.5小时，用超临界流体萃取技术提取，但是由于该技术操作较复杂，用时多，成本过高。所以，有一些科研工作者提出了还在试验阶段的一种低压溶剂，这种溶剂叫非氟氯酮溶剂，用它来提取中药中的一些活性物质，如丹参酮。刘本等科研工作者发现并整理了何种溶剂对川萼中川萼嗪提取的效率最优。通过实验他发现采用多索溶剂和超临界CO2加10%甲醇来提取川芽嗪时效率最优。吴青等科研工作者，采用双萃取法提取川茸，通过正交试验确定了川尊嗪的最优提取

8、工艺并解释了大致的提取操作步骤，加水量为总药材量的8倍，提取挥发油必须达到8个小时，冷却后收集挥发油为下一实验步骤做准备。将水提取部分在较高温对下过滤,从而减少川号嗪及有效物质的流失。过滤溶液的相对密度为1.01-1.02(55-60C),添加95%的乙醇使乙醵的含量达到百分之六十,然后冷库里储藏24小时,最后浓缩，在80C时减压干燥就可得到川尊嗪。因而，如何找到合理先进的提取方法，促进川苜制剂的现代化，是摆在广大科研工作者面前的重大课题。因此，本实验尝试通过控制变量的方法，找到较为合适的川茸嗪提取方法。经过各种实验研究，本实验最终选择了回流提取法，以优化川茸中川茸嗪提取工艺。第2章实验方法2

9、.1 色谱分析方法2.1.1 标准品配制及标准曲线绘制准确称取川苟嗪对照品1Omg,将其放于IOm1容量瓶中，采用甲醇溶液定容，配制成浓度为0.1mgm1的溶液。然后将以下剂量：0.2m1、0.4m1、1m1、2m1、4m1和8m1的对照储备液用胶头滴管吸取于IOm1容量瓶中，然后用甲醇溶液充分定容后摇匀，从而得到若干浓度条件下的对照品。再次取51对照品进样进行对照，获得并读取到液相色谱峰面积值。以浓度（C）为横坐标，以峰面积值（A）为纵坐标，进行线性回归，并得到线性回归方程为：Y=223.9x+10.85,r=0.9998,根据实验结果显示：在0.002-0.08mgm1内具有较好的线性关系

10、。详见图2.1。20120I0.0001.0002.0003.0004.0005.0006.0007.0008.0009.00010.000图2.1标准品配制标准曲线绘制2.1.2 精密度实验准确吸取对照品溶液51连续进样6次，按照上文所提到的实验方法进行测定并计算RSD值，所得RSD为0.48%,表明精密度良好，可以进行后续实验。详见表2.1o表2.1精密度实验结果（n=6）峰面积RSD%1273.97970.48%1279.06891274.75791257.23001296.48742.1.3 重复性实验准确吸取相同批次供实验所需的样品溶液中的6个样品，运用以上的方法进行准确测算RSD值

11、，获得RSD为2.59%,因此表明此方法重现性好，所以可以继续后面的实验。详见表2.2。表2.2重复性试验结果（n=6）峰面积川莺嗪的含量川苔嗪的平均含量RSD%1258.57012.7862.8462.59%1344.99552.9801265.98022.8021259.04532.7881289.96512.8561294.44152.8662.2提取溶剂的选择取川萼，粉碎后过筛，准确称量5.0g,共准备6份，以甲醇、乙酸乙酯、乙醇、丙酮、石油酸、水为提取溶剂，所需用量均为50m1,回流1Oh后，充分过滤，滤液经过减压浓缩并蒸干，用色谱甲醇充分溶解，定容后放入体积为IOm1的容器中，以此

12、获得供试品溶液”曳运用0.45m的微孔滤膜过滤溶液，取续滤液51进样至高效液相色谱中检测，测定川可嗪的峰面积,平行测定两次取平均值,代入标准曲线方程，获得川芳嗪浓度，进一步计算川号嗪含量。最后，将不同溶剂提取样品所对应的川茸嗪含量进行比较，以含量最大者为最佳，从而筛选出最佳提取溶剂。2.3 提取溶剂浓度的选择取得七片川苜药品将其进行充分粉碎，然后精确称取5.0g,共5份，将其分别加入20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液中，作为提取溶剂，使用量为50m1（10倍），回流1小时后，过滤，将滤液减压浓缩并蒸干，溶于色谱甲醇之中，充分定容于IOm1的容量瓶中，用0.45m微孔膜进行过滤，

13、以此获得供试品溶液，取得续滤液51进样到高效液相色谱中进行检测，通过检测获得其川茸嗪的峰面积，将所获得的试验结果取两次的平均值，将其代入线性方程，计算获得获得川苟嗪浓度，从而进一步计算提取得到的川耳嗪含量。2.4 提取次数的选择取川茸药材，粉碎过筛，精密称取5.0g,选取60%乙醇作为提取溶剂，加入总体积50m1,回流提取4次，且每次都提取3h。提取两次时，将第一次的提取液与川苗药材分离，随后重新加入到川苜药材中进行第二次提取。提取三次时，则在提取两次的基础上再重新分离一次，提取四次时以此类推。提取结束后，将每次的提取液收集起来，样品溶液经真空浓缩、蒸发后，溶于色谱甲醇中，置于IOmI容量瓶中

14、，得到供试品溶液,将所得到的四种供试品溶液分别用045m微孔膜依次进行过滤处理,然后将取得续滤液51并进样到高效液相色谱法（HP1C）中进行检测，随后测定川苟嗪的峰而积，试验结果取两次平行测定的平均值，将其代入线性方程进行计算，获得川苜嗪的浓度，从而进一步计算样品中川萼嗪的含量。2.5 提取液料比的选择据文献报道,川茸中川苜嗪的提取受液料比（即溶剂与药材的比例）的影响很大，因此，我们还考察了川苜中川可嗪的适宜液料比。取川茸七片，粉碎后过筛。准确称取5.0g,选用60%乙醛为提取溶剂，按6倍（3OmD、8倍（4mD、10倍（5OmD的料比加液，将其回流提取1次，提取时间为3小时，随后收集各提取液

15、，进行减压浓缩并蒸干，运用色谱甲醇溶解，充分定容于IOm1玻璃杯中，然后获得供试品溶液。将四种供试品溶液依次分别通过0.45m微孔滤膜，取得的续滤液51进样到HP1C中检测，随后测定川耳嗪的峰面积值，平行测定两次取值并取其平均值后代入线性方程，获得川茸嗪的浓度，进一步计算样品中川芽嗪的含量。2.6 川苛嗪提取工艺的优化在探究川苛中川茸嗪的最恰当提取工艺中，以单因素实验为基础,进一步选取乙醇浓度（A）、液料比（B）和提取次数（C）3个最主要的影响因素，运用19Q3）正交表法，各因素水平如下表2.1所示，准确进行正交试验，并对实验所取得的结果进行分析，确定提取川茸嗪的最佳工艺。精密称取川萼药材，进行充分粉碎后过筛，准确称取5.0g,按照下面表格所列的实验因素及水平进行实验，并利用线性回归方程计算川茸嗪浓度，进一步求得相应的川耳嗪含量，通过正交分析，从而确定最佳提取工艺。表2.1正交试验因素水平因素ABC水平乙醇浓度（）液料比（倍）提取次数160%62280%833100%1042.7验证性实验取川苗粉末10.0g各三份，分别加入50Om1的圆底烧瓶中，按照上述实验得到的提取川号中川尊嗪的最优提