细胞建株系 培养.docx

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1、细胞建株(系)培养一、概念1、细胞系(CeI11ine)：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系(1ineageofCe11s)所组成。2、细胞株(CenStrain)：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株(finitece11strain)；如果可以连续传代，称为连续细胞株(COntinUOUSCenStrain)O对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。二、建立细胞系(或株)的要求

2、什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明：1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；个体性别、年龄；取材的器官或组织。如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。2、细胞生物学检测：了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。3、培养条件和方法；应说明细胞系(或株)适应的生

3、存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。三、若干细胞建株的要点及基本过程(一)肿瘤细胞培养技术要点1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率根据实验经验，肿瘤细胞在

4、体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。（二）人类淋巴母细胞建株方法1、4m1肝素抗凝血于离心管中，加入2m1RPMI1640。2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4m1淋巴细胞分离液的液面上静置30mino31500rpm,15min,吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。4、加RPMI16405m1洗涤白细胞两次。5、将白细胞

5、接种至Im1RPMI1640培养基中，加入101环胞霉素和1001的EBV（EB病毒）液,混匀。6、水浴摇床，40次/分，37,3hr1500rpm,15min,吸取白细胞层(第二层)于另一离心管中。4、加RPMI16405m1洗涤白细胞两次。5、将白细胞接种至ImIRPMII640培养基中，加入101环胞霉素和1001的EBV(EB病毒)液，混匀。6、水浴摇床，40次/分,37,3hro71500rpm,15mino将细胞接种至Im1培养基中(内含谷氨酰胺ImM/m1)加入101环胞霉素，轻轻混匀，37培养。8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。一般半量换液12次，并维持环胞霉

6、素的浓度。9、待转化细胞数量明显上升，并出现细胞团块后，可转入25m1细胞培养瓶中，加12m1培养基，37C培养1015天，一般每隔3-4天观察一次，决定是否换液,传代。10、细胞生长达一定数量后冻存，冻存前应进行核型分析和存档。离心机转数与离心力的换算RPM(revo1utionperminute)为离心机每分钟的转数;RCF(re1ativecentrifuga1fie1d)为相对离心场，以重力加速度g(980.66cms2)的倍数来表示。RCF与每分钟的转数RPM(rmin)以及离心机旋转轴到离心管中间的距离，即平均半径r(以Cm表示)的关系为：RCF=1.119X10-5X(rpm)2

7、Xr离心速度和离心力的换算换算法：在r标尺（单位rpm上取已知转速.在RCF标尺上取已知的禽心半径（单位cm.将这两点作一直线相连.直浅所通过的g标尺上的交叉点即为相应的离心力.细胞离心技术（一）、差速离心（differentia1centrifuga1ion）在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复23次效果会好一些。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞

8、器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀（二）、密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化钠，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。(A)-FRACTIONATION-*samp1esteop

9、sucrosegradient(e.g.,20-70%)1owbuoyant.3-densitycomponent产伙YXKponentS1ow-SodimeniingM42componentfast-sedimentingcomponentFrccnTh*ArtofMeOC19956r1*ndPub1ishing,rA等速度沉降，B等密度沉降1、速度沉降速度沉降(VeIOeitySedimentation)主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒(细胞或细器)在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数

10、以不同的速度沉降而达到分离。2、等密度沉降等密度沉降(isopycnicsedimentation)适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。再者，这种方法所需要的力场通常比速率沉降法大10100倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。大细胞比小细胞更易受高离心力的损伤，而且停留在等密度介质中的细胞

11、比处在移动中的细胞受到更大的损伤。因此，这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。3、氟尿喘咤：别名：5氟尿喀咤英文名：F1uorouraci1(5FU)0作用与用途：本品为啥陡类的氟化物，属于抗代谢抗肿瘤药，能抑制胸腺喀咤核甘酸合成酶，阻断脱氧喀咤核苜酸转换成胸腺喀咤核甘核，干扰DNA合成。对RNA的合成也有一定的抑制作用。操作：在神经元培养时可以用来抑制胶质的生长。4、1-谷氨酰氨：资料：氨基酸是组成蛋白质的基本单位.不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸.其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡.因此,各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺.但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置于-20冰箱中保存,在使用前加入