细胞培养无菌操作基本技术.docx

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1、细胞培养无菌操作基本技术实验前,无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60分钟灭菌,用70%酒精擦拭无菌操作台面,并开启无菌操作台风机运转10分钟后,才可开始实验操作.每次操作只处理一株细胞,以免造成细胞交叉污染.实验结束后,将实验物品带出工作台.如需要继续进行下一个实验,则用70%酒精擦拭无菌操作台面,再让无菌操作台风机运转10分钟后,才可进行下一个实验操作.(2)无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞,必要物品,如试管架,移液器或吸管头等可以暂时放置,其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通.实验用品要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内.实验操作应在操作台中央无菌区域内进行,勿在边缘非无菌区

2、域操作.(3)小心取出无菌实验用品,避免造成污染.切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口,不要在打开的容器正上方操作实验.容器打开后,用手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45。角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上.(4)工作人员应注意自身的安全,必须穿戴实验衣与手套后才进行实验.对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心,并选择适当等级的无菌操作台(至少两级).操作过程中,应避免引起气溶胶的产生,小心有毒性试剂,例如DMSO及TPA等,并避免尖锐物品伤人等.(5)定期检查下列项目:CO2钢瓶内的CO2压力;Co2培养箱内的CO2浓度,温度,及水盘是否有污染;无菌操作台内气流压力是否正常,定期更换紫外灯管

3、及HEPA过滤器滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000小时/HEPA).细胞培养基种类与基本成分氨基酸氨基酸是组成蛋白质的基本单位.不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸.其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡.因此,各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺.但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置于-20C冰箱中保存,在使用前加入培养液内.已含谷氨酰胺的培养液在4冰箱中储存2周以上时,还应重新加入原来量的谷氨酰胺.碳水化合物碳水化合物是细胞生长主要能量来源,其中有的是合成蛋白质

4、和核酸的成分.主要有葡萄糖,核糖,脱氧核糖,丙酮酸钠和醋酸等.无机盐培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡.此外,通过提供钠,钾和钙离子,帮助细胞调节细胞膜功能.培养液的渗透压是一个非常重要的因素，细胞通常可耐受26OmOSmZkg320msmkg.标准培养液的渗透压在此范围内波动.特别注意:向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压,特别是溶于强酸或强碱中的物质.向培养液中添加HEPES时需按以下方法调节钠离子浓度.缓冲系统大多数细胞所需PH在7.27.4.但是,细胞培养最适PH值随培养的细胞种类不同而不同.成纤维细胞喜欢较高PH(7.4-7.7),而传代转化细胞系则需要

5、偏酸PH(7.0-7.4).由于多数培养液靠碳酸氢钠(NaHCo3)与CO2体系进行缓冲,因此,气相中的CO2浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡.如果气相或培养箱空气中CO2浓度设定在5%,培养液中NaHCO3的加入量为1.97g1;如果CO2浓度维持在10%,培养液中NaHCO3的加入量为3.95g1.细胞培养瓶盖不应拧得太紧,以保证气体交换.HEPES是一种非离子缓冲液,在PH7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力,但是非常昂贵,在高浓度时对一些细胞可能有毒.HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠(0.34g1洪用,以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加.在这种培养条件下,细胞培养瓶的盖子

6、应拧紧,以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中.大多数培养液中含有酚红作为PH指示剂,酸性培养液呈橙黄色,碱性培养液呈深红色.维生素在细胞培养中,尽管血清是维生素重要来源，但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长.其它成分在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分.如在杂交瘤技术中常用的DMEM培养液,使用时还需要补加丙酮酸钠和2-筑基乙醇(2-MerCaPtOethano1,2-Me).2-Me对细胞生长有很重要的作用.有人认为它相当于胎牛血清,有直接刺激细胞增殖作用.2-Me的活性部分是硫氢基,其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽,能诱导细胞的增殖,为非特异

7、性的激活作用.同时避免过氧化物对培养细胞的损害.另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA合成,增加植物凝集素(PHA)对淋巴细胞的转化作用,已广泛应用于杂交瘤技术,另外,也开始用于一些难以培养的细胞.2-Me是一种小分子还原剂,极易氧化.分子量为78.13,纯的2-Me是一种无色有刺激味的液体,比重为1.110-1.120(口020),常用终浓度为5乂10-51.常配制成0.111的储存液,用时每升培养液加0.5m1.细胞计数与存活测试1 .原理：1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是CoU1terCOUrIter粒子计数器自动计数。1.2. 血球计数盘一般有二个ChamberS,每个Cha

8、mber中细刻9个Imm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当Chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为Imm2X0.Imm=I.0X10-4m1。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104,即为每m1中之细胞数目。1.3. 存活测试之步骤为dyeexc1usion,利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanb1ue染料，如果细胞不易吸收trypanb1ue,则用红色之Erythrosinb1uish02 .材料：2.1. 0.4%w/vtrypanb1ue(Gibco

9、BR115250-061)2.2. Erythosinb1uishstain取0.1gramErythrosinb1uish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethy1paraben(SigmaH-3647)溶于100m1Ca/Mgfreesa1ine2.3. 血球计数盘及盖玻片(HemOCytometerandcovers1ip)2.4. 计数器(CoUnter)2.5. 低倍倒立显微镜2.6. 粒子计数器(COU1tercounter,Cou1terE1ectronics)3 .步骤：3.1. 取50m1细胞悬浮液与50m1trypanb1ue(orEr

10、ythrosinb1uish)等体积混合均匀于1.5m1小离心管中。3.2. 取少许混合液(约15m1)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinb1uish)03.3. 计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数（至少乘以2,因与trypanb1ue等体积混合）,最后乘以104,即为每m1中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞（或计下线与左线之细胞）。4大格*细胞总数x2X104/4=细胞数/m1*每一大格的体积=0.1cmX0.1cmx0.01cm=10-4m13.4.

11、若不用血球计数盘，可用COU1terCoUmer作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。3.5. 范例：T75mono1ayercu1ture制成Iom1细胞悬浮液,取0.1m1溶液与0.1m1trypanb1ue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数/方格：55,62,49,59死细胞数/方格：5,3,4,6细胞总数二243平均细胞数/方格=60.75稀释倍数=2aS胞数/m1：60.75x104x2=1.22x106细胞数/f1ask：1.22x106xIOm1=12.2x106存活率：225/243=92.6%细胞培养培养基1 .液体培养基贮存于4

12、oC冰箱，避免光照，实验进行前放在37OC水槽中温热。2 .液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间g1utamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量g1utamine。3 .粉末培养基配制（以1升为例）：3.1. 细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900m1,pH为7.2-7.4oNaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成PH之误差,或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH,而非用强酸（HC1）或强碱（NaoH）,因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的PH易发生改变。3.2

13、. 材料：3.2.1. 纯水(mi11i-Q水或二次至三次蒸储水，水品质非常重要)3.2.2. 粉末培养基3.2.3. NaHC03(SigmaS-4019)3.2.4. 电磁搅拌器3.2.5. 无菌血清瓶3.2.6. 0.1或0.2mm无菌过滤膜3.2.7. pHmeter328.真空帮浦3.2.9. CO2气体3.3. 步骤：3.3.1. 取粉末培养基溶于70Om1mi1KQ水中，搅拌使其溶解。3.3.2. 称取适量之NaHCO3粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于2(X)m1mi11i-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入Co2气体至饱和，约35分钟。3.3.3. 将溶解且含饱和CO2之Na

14、HCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之PH应为7.2-74,除非PH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2气体调整pH培养基以真空帮浦通过过滤膜时，PH会升高0.1-0.2。3.3.4. 以0.1或0.2mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4oC。(血清亦可加入培养基中一起过滤)3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。4 .配制培养基之生长测试4.3. 材料：4.3.1. MDCKce11(ATCCCC1-34或CCRC60004)4.3.2. 6-we11TCp1ate(or35mmTCdish)4

15、.3.3. methano14.3.4. g1acia1aceticacid4.3.5. 10%Giemsaso1ution(GibcoBR110092-013)4.4. 步骤：4.4.1. 以待测试培养基培养MDCKce11,接种MDCK细胞于6-we11p1ate(或35mmTCdish)中，每个WeI1接种I102活细胞，同时作对照组实验。4.4.2. 接种57天后，在IOO倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。4.4.3. 去除培养基，加入1m1Carnoy固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）,室温下静置10mino4.4.4. 去除固定液，

16、水洗二次。4.4.5. 加入1m110%Giemsaso1ution,室温下静置染色2-3min。4.4.6. 去除染液，水洗二次。427.以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。无菌操作注意事项体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室。若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而.为在一切操作中为最大可能的保证无菌.每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所（培养室、超净台）内，然后开始消毒