培养细胞的生长和增殖过程.docx

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1、培养细胞的生长和增殖过程体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代(Passage(Subcu1ture)0每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。另外，很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存也不是无限的，存在着一个发展过程。所有这一切，使组织细胞在培养中有着一系列与体内不同的生存特点O(一)培养细胞生命期(1ifeSpanofCu1tureCe11s)所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的

2、生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。组织和细胞在培养中生命期如何？这要看细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况。人胚二倍体成纤维细胞培养,在不冻存和反复传代条件下,可传3050代,相当于150300个细胞增殖周期，能维待一年左右的生存时间，最后衰老凋亡(Apoptosis)。如供体为成体或衰老个体,则生存时间较短;如培养的为其它细胞如肝细胞或肾细胞,生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时,细胞的生存期才可能发生改变。对此以后将详述。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段：1 .原代培养(Primar

3、yCU1tUre)期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的(Heterogeneous),也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率(C1oningEfficiency)很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群(克隆)的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对

4、象。2 .传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系(CeII1ine)0在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系(Dip1oidCe111ine)o为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10-50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。3 .衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在

5、细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点(多发生在传代末或衰退期)，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化(SPOntaneOUSTranSformatiOn)。转化的标志之一是细胞可能获得永生性(Immorta1ity)或恶性性(Ma1ignancy)。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系(InfiniteCe111ine),也称连续细胞系(ContinuousCe111ine)o在早期文献中无限细胞系也称已建立细胞系(EStab1iShedCeII1ine),现已不用。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变

6、成异倍体(HeteropIoid)O细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。(二)组织培养细胞一代生存期所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快(实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。所谓细胞“一代一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这

7、已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代(Generation)或倍增(Doub1ing)不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：1 .潜伏期(1atentPhase)：细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养细胞贴附慢，可长达1024小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，10-30分钟

8、即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素(Fibronectin),又称1ETS(1argerExterna1TransformationSubstance),细胞表面蛋白(CeIISUrfaCePrOtein：CSP)等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面(如CSP),有的则来自培养基中的血清(1ETS)。近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。细胞贴附于支持物后，除先经过前

9、述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖,少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长，约2496小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅624小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。2 .指数增生期(1ogarithmicgrowthPhase):这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂(MitotiCIndex：M1)表示，即细胞群中每IOO

10、O个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.1%0.5%,初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%5%pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制(Contactnhibition)o而恶性细胞则无接触抑制现象，因

11、此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积(PiIedup)o细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制(DensityInhibition),导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念，不应混淆。3 .停滞期(StagnatePhase)：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖,进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期(PIateaU)。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、PH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚(已有中毒迹象)能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传12两代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。结果反而耽误了时间，这是在实验中应特别注意的。