禽流感病毒H5亚型（H5–Re14株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清 兽药产品说明书和内包装标签.docx

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1、禽流感病毒H5亚型（H5-Rel4株）血凝抑制试验抗原、rH性血清与阴性血清兽药产品说明书和内包装标签（一）禽流感病毒H5亚型（H5-Re14株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清说明书【兽药名称】通用名 禽流感病毒H5亚型（H5-Rel4株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清商品名无英文名 Avian Influenza Virus （H5 Subtype, Strain H5 - Rcl4） Hemagglutination InhibitionTest Antigen, Positive Sera and Negative Sera汉语拼音 Qinliuganbingdu H5 Ya

2、xing （H5 - Re 14 zhu） XueningyizhishiyanKangyuan,Yangxingxueqing Yu Yinxingxueqing【主要成分与含量】 抗原为灭活的H5亚型禽流感病毒（H5-Rel4株），血凝（HA）效价不低于1 ： 128。测定鸡血清时，分别使用禽流感病毒H5亚型（H5-Rel4株）鸡阳性血清和禽流感病毒HI试验鸡阴性血清作为对照血清，阳性血清血凝抑制（HI）抗体效价不低于1 :128,阴性血清HI抗体效价不高于1 ： 4。测定鸭和鹅血清时，分别使用禽流感病毒H5亚型（H5-Rel4株）鸭阳性血清和禽流感病毒HI试验鸭阴性血清作为对照血清，处理

3、后的鸭阳性血清HI抗体效价不低于1 : 80,阴性血清HI抗体效价低于1 ： 10o【性状】 抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块；阳性血清和阴性血清为微黄色或淡红色海绵状疏松团块。易于与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。【作用与用途】用于HI试验检测禽流感病毒H5亚型（H5 - Rel4株）抗体。【用法与判定】1材料1.1 96孔V型（9（）度）微量反应板、单道及多道微量移液器（配有吸头）、加样槽、吸管、烧杯等。1.2 pH值7.（）7.2（）.（）lmol/LPBS按照如下方法配制或购买商品化产品，PBS 一经使用，于28保存不超过3周。PBS配制方法：秤量NaC180g、KC1 2g、十二水磷酸

4、氢二钠36.3g、磷酸二氢钾2.4g,溶解于ddH2O中，并定容10L,用氢氧化钠或盐酸调pH至7.07.2,最后121 灭菌30分钟或过滤后使用。1.3 阿氏（Alsevers）液 称葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g,加蒸IS水至100ml,加热溶解后调pH值至6.1, 69Kpa 15min高压灭菌，2c8c保存备用。1.4 1%鸡红细胞悬液 采取24只26月龄SPF鸡的血液，与等量阿氏液混合，然后用PBS （0.01mol/L, pH值7.07.2,下同）洗涤34次，每次以150（h7min离心510分钟，将沉积的红细胞用PBS配制成1%悬液。1.

5、5 抗原溶解冻干的抗原和血清均按瓶签规格标注的量，用PBS溶解。2操作术式2.1 血凝（HA）试验2.1.1 在V型微量反应板中，每孔加0.025ml PBS。2.1.2 第1孔加0.025ml抗原，反复抽打35次混匀。2.1.3 从第1孔吸取0.025ml抗原加入第2孔，混匀后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行2倍系列稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025ml弃去。2.1.4 每孔加 0.025ml PBS。2.1.5 每孔加入0.025ml 1% （V/V）鸡红细胞悬液。2.1.6 结果判定将反应板在振荡器上震荡12分钟或轻扣反应板混合反应物，置室温2030分钟或置28 4560分钟

6、，当对照孔的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。判定时，将反应板倾斜60度，观察红细胞有无泪珠状流淌，完全无泪珠样流淌（100%凝集）的最高稀释倍数判为血凝效价。2.2 血凝抑制（HI）试验（鸭、鹅血清，必要时需要进行前处理，参考方法见注意事项）2.2.1 根据HA试验测定的效价，如果抗原凝集价测定结果为1 ： 1024 （举例），4个血凝单位（即 4HAU） =1024/4=256 （即 1 ： 256）。取 PBS9.0ml,加抗原 1.0ml,即成 1 ： 10 稀释，将1 ： 10稀释液1.0ml加入到24.6 ml PBS中，使最终浓度为1 : 256。2.2.2 四个单位血凝单位检测 检

7、查4 HAU的血凝价是否准确，应将配制的1 ： 256稀释液进行系列稀释，使最终稀释度为1 ： 2、1 ： 3、1 ： 4、1 ： 5、1 ： 6和1 ： 7。然后，从每一稀释度中取0.025ml,加入PBS 0.025mL再加入1%鸡红细胞悬液0.025ml,混匀。将血凝板置室温2040分钟或置28c 4060分钟，如果配制的抗原液为4HAU,则1 ： 4稀释度将给出凝集终点；如果4HAU高于4个单位，可能1 ： 5或1 ： 6为终点；如果较低，可能1 ： 2或1 ：3为终点。应根据检验结果将抗原稀释度做适当调整，使工作液确为4HAU。2.2.3 第 211 孔加入 0.025ml PBS,

8、第 12 孔加入 0.05ml PBS。2.2.4 第12孔加入0.025ml血清，第2孔血清与PBS充分混匀后吸0.025ml于第3孔,依次2倍系列稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025ml弃去。2.2.5 第1 11孔均力口入0.025ml的4HAU抗原,在室温（2025）下静置至少20分钟或2c8c至少60分钟。2.2.6 每孔加入0.025mH% （V/V）的鸡红细胞悬液，震荡混匀，在室温（2025）下静置2040分钟或2c8 4060分钟，对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果。3结果判定 以完全抑制4 HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI抗体效价。当阳性对照血清的HI抗体效价

9、与己知抗体效价误差不超过1个滴度，鸡阴性对照血清抗体效价不高于1 : 4 （若用处理后的鸭阴性血清，则抗体效价应低于1 ： 10）时，试验方可成立。检测鸡血清时，被检血清HI抗体效价不高于1 ： 8判为阴性，不低于1 ： 16判为阳性；检测处理后的鸭和鹅血清时，被检血清HI抗体效价低于1 ： 10判为阴性，不低于1 ： 10判为阳性。【注意事项】 （1）HA和HI试验影响因素甚多，应严格控制试验条件。每加一试剂或样品后需更换吸头，同时应严格控制作用温度和时间。（2）准确配制红细胞悬液，使用时应随时振摇。（3）用pH值7.07.2的PBS （0.01 mol/L）作为稀释液。（4）抗原和阴、阳性

10、血清若有污染，应废弃。（5）准确配制4HAU抗原，使用前需进行滴定，滴定好的抗原应在2小时内用完。（6）抗原和血清按规定保存。冻干试剂应按规定的体积用PBS溶解。溶解后28c保存不超过1个月。（7）同一亚型不同毒株的HI试验抗原，若抗原性存在差异，则检测同一血清的HI抗体效价不同。（8）鸭、鹅血清一般需进行非特异性凝集抑制素的处理，并以鸭阳性血清作为HI试验阳性对照血清。处理参考如下方法，可根据本实验室实际情况选择使用。胰酶-加热-高碘酸盐法A.取0.3ml血清，加0.15ml胰酶溶液（8mg/ml： 200mg的P - 250胰酶溶解于25ml的0.01mol/L,pH值7.07.2的PBS

11、中，混匀，过滤除菌，分装并在-15以下保存，保存期6个月），混匀后，在56水浴灭活30分钟后冷却至室温。B.再加入 0.9ml 高碘酸钾（将 230mg 的 KIO4 用 0.01mol/L, PH 7.0 - 7.2 的 PBS,定容至100ml,过滤除菌后避光室温保存，保存期1周），混合，室温孵育15分钟。C.再力口入0.9ml的丙三醇盐溶液（1ml的丙三醇加入到99ml的（）.01mol/L, pH值7.（）7.2的PBS中，混匀，过滤除菌，室温保存），混合，室温孵育15分钟。D.最后加入0.75ml生理盐水，混匀，置4保存备用。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。受体破坏酶（RDE）处

12、理法A.取1体积血清（50.1）,加4体积RDE （200111）, 37水浴18小时（过夜）。B.再加入5体积（250可）的1.5%浓度的柠檬酸钠，混匀，置56水浴30分钟（以破坏残余的RDE活性）。C.将1体积的50%的红细胞加入到10体积RDE处理的血清中（50川红细胞+500川血清），震荡混匀后4放置1小时，期间可轻轻摇匀悬浮红细胞数次。D.然后1000g离心10分钟，小心吸取上层上清，用于检测。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。【规格】1ml/瓶（2） 2ml/瓶【包装】【贮藏与有效期】T5C以下保存，有效期为24个月。【批准文号】【生产企业】仅供兽医诊断使用（二）禽流感病毒H5亚

13、型（H5-Re14株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清内包装标签禽流感病毒H5亚型（H5-Rel4株）血凝抑制试验抗原1 (2) ml/瓶生产文号：批 号：生产日期：【作用与用途】 用于HI试验检测禽流感病毒H5亚型（H5-Rel4株）抗体。【用法与判定】见使用说明书。【贮藏与有效期】-15以下，有效期为24个月。【生产企业】仅供兽医诊断使用禽流感病毒H5亚型（H5-Rel4株）阳性血清（鸡）1 (2) ml/瓶批 号：生产日期：【作用与用途】 用于禽流感病毒H5亚型（H5 - Rel4株）HI试验阳性对照。【用法与判定】见使用说明书。【贮藏与有效期】T5c以下，有效期为24个月。【生产企

14、业】仅供兽医诊断使用禽流感病毒H5亚型（H5-Rel4株）阳性血清（鸭）兽用1 （2） ml/瓶批 号：生产日期：【作用与用途】 用于禽流感病毒H5亚型（H5 - Rel4株）HI试验阳性对照。【用法与判定】见使用说明书。【贮藏与有效期】 T5C以下，有效期为24个月。【生产企业】仅供兽医诊断使用禽流感病毒血凝抑制试验阴性血清（鸡）1 (2) ml/瓶批 号:生产日期:【作用与用途】【用法与判定】【贮藏与有效期】【生产企业】(鸭)用于禽流感病毒HI试验阴性对照。见使用说明书。-15以下，有效期为24个月。仅供兽医诊断使用禽流感病毒血凝抑制试验阴性血清1 (2) ml/瓶批 号:生产日期:【作用与用途】【用法与判定】【贮藏与有效期】【生产企业】用于禽流感病毒HI试验阴性对照。见使用说明书。75c以下，有效期为24个月。仅供兽医诊断使用