脯氨酸PRO含量测定试剂盒说明书微量法100管96样.docx

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1、脯氨酸（PRO）含测定试剂盒说明书微法100管/96样注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义：Pro广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro含量显著增加。PrO增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。渊定原理：用磺基水杨酸（SA）提取Pro,加热处理后，PrO与酸性薛三酮溶液反应生成红色；加甲苯萃取后，在52Onm测定吸光度。需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、冰乙酸25m1、甲苯50m1、研钵、

2、冰和蒸储水。试剂的组成和配制：提取液：液体IoOm1X1瓶，4匕保存。试剂一：冰乙酸25m1x1瓶，4保存。（自备）试剂二：液体25m1x1瓶，4保存。试剂三：甲苯50m1x1瓶，4保存。（自备）样品渊定的准备：1、细菌、细胞或组织样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（IO4个）：提取液体积（m1）为5001000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入Im1提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次）；之后置90振荡提取IOmin：10000g,25tC离心IOmiib取上清,冷却后待测。组织

3、：按照组织质量（g）：提取液体枳（m1）为1：510的比例（建议称取约0.1g组织，加入Im1提取液），进行冰浴匀浆；之后置9（C振荡提取IOmin；IoooOg,25C离心Iomin,取上清，冷却后待测。2、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（m1）：提取液体积（m1）为1：510的比例（建议取0.1m1血清（浆）加入Im1提取液），充分混匀，之后置9（C浴振荡提取10分钟，10000g,25离心10分钟，取上清，冷却后待测。渊定步骤：1、分光光度计或函标仪预热30min以上，调节波长至520nm,蒸储水调零。2、样本测定：（1）取0.25m1样本+025m1试剂一+0.25m1试剂二于有盖

4、EP管中，置沸水浴中保温30min（盖紧，防止水分散失），每IOmin振荡一次。(2)待冷却后，加入0.5m1试剂三，振荡30s,静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.2m1上层溶液于微量石英比色皿或96孔板中，于520nm波长处比色，记录吸光值A。Pro含计算：a用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、典型回归方程y=0.0521x-00021(X为脯氨酸含量，gm1;y为吸光值A)2、按照血清(浆)体枳计算Pro含量(gm1)=(A+0.0021)0.0521V1(V3V1V2)=192(A+0.0021)3、按照蛋白浓度计算Pro含量3gmgprot)=(A+0.0021)0.0521V1

5、(V1Cpr)=19.2(A+0.0021)Cpr4、按照样本质量计算Pro含量(gg鲜市)=(A+0.0021)0.0521V1(WV1V2)=19.2(A+0.0021)W5、按照细菌或细胞密度计算Pro含量(gO4ce11)=(A+0.0021)0.0521V1(500V1V2)=0.0384(A+0.0021)VI：加入反应体系中样本体积，0.25m1；V2：加入提取液体积，1m1；V3：加入血清(浆)体积，0.1m1；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。b.用96孔板测定的计算公式如下1、典型回归方程y=0.02605x0.0021

6、(X为脯氨酸含量，gm1;y为吸光值A)2、按照血清(浆)体枳计算Pro含量(gm1)=(A+0.0021)0.02605V1(V3V1V2)=384(A+0.0021)3、按照蛋白浓度计算Pro含量(gmgprot)=(A+0.0021)0.02605V1(V1Cpr)=38.4(A+0.0021)Cpr4、按照样本质量计算Pro含量(gg鲜重尸(A+0.0021).02605xV1(WxV1V2)=38.4x(A+0.0021)W3、按照细菌或细胞密度计算Pro含量(gO4ce11)=(A+0.0021)0.02605V1(500V1V2)=0.0769(A+0.0021)VI：加入反应体系中样本体积，0.25m1；V2：加入提取液体积，1m1；V3：加入血清(浆)体积，0.1m1；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。注意I最低检测限为1gm1o优利科(上海)生科学有暇又