线粒体异柠檬酸脱氢酶ICDHm试剂盒说明书微量法100管96样.docx
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1、线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)试剂盒说明书微法100管/96样注意s正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义:ICDHm(EC1.1.1,41)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,在三拨酸循中催化异柠檬酸生成酮戊二酸,同时将NAD+还原为NADH,是三粉酸循环的限速酶之一,其催化的反应是细胞NADH主要来源之一。渊定原理:ICDHm催化NAD+还原生成NADH,导致34Onm处光吸收上升。需自备的仪器和用品紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水。试剂的组成和配制:试剂一:10Om1X1瓶,20C保
2、存;试剂二:20m11瓶,-20C保存;试剂三:ISm1x1支,-20C保存:试剂四:液体20m1x1瓶,4C保存;试剂五:粉剂X1支,4匕保存;试剂六:粉剂X1支,2(TC保存;样本的前处理:组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:1、称取约S1g组织或收集500万细胞,加入Im1试剂一和IOU1试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。2、将匀浆600g,42离心5min.3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4C离心IOmin。4、上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的ICDHm(此步可选做)。5、在步骤的沉淀中加入200U1试剂二和2u1试剂三,超声波破碎(冰浴,功率2
3、0%或200W,超声3秒,间隔K)秒,重复30次),用于线粒体ICDHm活性测定。渊定步骤:1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸储水调零。2、样本测定(1)在试剂五中加入18m1试剂四充分溶解,置于374C(哺乳动物)或25(其它物种)水浴IOmin;用不完的试剂分装后-20C保存,禁止反复冻融;(2)在试剂六中加入Im1蒸馆水,充分溶解待用:用不完的试剂分装后-20C保存,禁止反复冻融;(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入IOU1样本、K)U1试剂六和180J1试剂五,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和2min20s后的吸光值A2,计算4A=A2
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