线粒体柠檬酸Mitochondrioncitricacid,MCA含量试剂盒说明书.docx

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1、线粒体柠檬酸(MitoChOndriOnCitriCaCid,MCA)含试剂盒说明书微法100管/96样注意s正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定渊定意义：MCA是线粒体三枝酸循环的第一个中间产物，由柠檬酸合酶催化乙酰COA与草酰乙酸合成，其含量是三按酸循环强度的主要指标之一。配合测定丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性、乙酰CoA含量、柠檬酸合酶活性和MCA含量，其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脱氢酶活性变化可以反映糖酵解进行程度，（2）综合分析丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性和乙酰COA含量变化可以反映脂肪酸B氧化途径提供的乙酰COA情况，（3）乙酰COA含量、柠檬酸合酶活性和MCA含量变化

2、可以反映三竣酸循环进行状况。渊定原理：MCA在柠檬酸裂解函的作用下，生成-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性条件下，。-酮酸进一步与苯朋反应,生成相应的酮酸苯腺；-酮酸苯腺在330nm处有吸收峰，该波长下吸光度的变化程度可反映出MCA的含量。自备仪器和用品：分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液枪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵、蒸储水。试剂组成和配制：酸性提取液：液体IOom1X1瓶，4*C保存。碱性提取液：液体IOom1X1瓶，4七保存。试剂一：液体6m1x1瓶，4七保存。试剂二：液体2m1x1瓶，4C保存。试剂三：粉剂X1瓶，4匕保存：临用前加入6m1蒸憎水充分溶解待用；用不完的试剂4

3、七保存：标准液：液体Im1X1支，10mo1m1柠椽酸标准液，4保存。线粒体中柠檬酸提取：称0.05-0.Ig样品（建议称0.1g样本），加入0.5m1酸性提取液,冰上充分研磨，600gmin4*C离心5min；取上清至另一EP管中，I1OOogzmin4C离心Iomin,弃上清（取300J1该上清液和300U1碱性提取液中和后可用于细胞质CA含量测定）；沉淀即线粒体，向沉淀中加入0.5m1酸性提取液，充分悬浮溶解，超声波破碎（功率20%,超声3秒，间隔10秒，重复30次），取此溶液300U1和300J1碱性提取液中和，混匀，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。渊定步事：1、分光光度计或酶标

4、仪预热30min以上，调节波长到330nm,蒸储水调零。2、试剂一、二和三37七预热Iomin。3、样本测定：空白管和标准管只需要各做一个。试剂名称（1）空白管标准管测定管试剂一606060蒸储水60标准液60样本60试剂二202020试剂三606060充分混匀，33（）nm立即测定初始吸光值AI和37C孵育30min后的吸光值A2,A=A2-A1o柠It酸含量计算：（I）按蛋白浓度计算柠檬酸含量（mo1mgProt）=C标准管X（AA测定管一AA空白管）（AA标准管一AA空白管）XV样上（V样Cpr）=10（A测定管一AA空白管）（AA标准管一AA空白管）Cpr蛋白质含量需要另外测定。（2）按样本鲜重计算柠檬酸含量（mo1/g鲜重）=C标准管X（AA测定管一AA空白管）（AA标准管一AA空白管）XV样（WV样V样总）=10（A测定管一AA空白管）+（AA标准管一AA空白管）WC标准管：标准液浓度，10mo1m1;V样：加入反应体系中样本体积：0.06m1：V样总：加入提取液体积：Irn1：Cpr：样品蛋白浓度，mg/m1：W：样本质量，g。注意：最低检测限为IOnmO1mgprot或1mo1g鲜重。优利科（上海）生叁科学有限X