线粒体苹果酸脱氢酶MDHm试剂盒说明书微量法100管96样.docx

《线粒体苹果酸脱氢酶MDHm试剂盒说明书微量法100管96样.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《线粒体苹果酸脱氢酶MDHm试剂盒说明书微量法100管96样.docx（2页珍藏版）》请在第一文库网上搜索。

1、线粒体苹果酸脱氢酶（MDHm）试剂盒说明书微法10。管/96样注意s正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义：MDH（EC1.1.137）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬第酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅所特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH,细菌中通常只含有NAD-MDH,在真核细胞中，N

2、AD-MDH分布于细胞质和线粒体中。渊定原理：MDHm催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致34Onm处光吸收卜.降。需自备的仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馆水。试剂的组成和配制：试剂一：10Om1XI瓶，20C保存；试剂二：20m11瓶，-2（TC保存；试剂三：15m11支，-20tC保存：试剂四、液体20m1x1瓶，在42保存：试剂五、粉剂X1瓶，20保存；样本渊定的准备：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：1、称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入Im1试剂一和IOU1试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。2、

3、将匀浆液于600g,4C离心5min.3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g,4C离心IOmin。4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的MDH（此步可选做）。5、在步骤的沉淀中加入200U1试剂二和2u1试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20%或200W,超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于MDHm活性测定。渊定步骤：1、分光光度计或函标仪预热30min以上，调节波长至340nm,蒸储水调零。2、检测工作液的配制：用时在试剂五中加入19m1试剂四和0.5m1蒸馅水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-2（C保存，禁止反竟冻融。3、测定前将检测工作液在37tC（哺乳动物）或2

4、5C（其它物种）水浴IOmin以上。4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5U1样本和195U1工作液，混匀后立即记录34Onm处20s时的吸光值A1和Imin20s后的吸光值A2,计算AA=AI-A2。MDHm活力单位的计算：H.用微量石英比色皿测定的计算公式如下（1）按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmo1的NADH定义为一个酶活力单位。MDHm（nmo1/min/mgprot）=AAV反总（d）x1（）9（V样XCPr）T=6430*AACpr（2）按样本鲜重计算：单位的定义：银g组织每分钟消耗1nmo1的NADH定义为一个防活力单位。MDHm（nmo1/min/

5、g鲜重）=AAV反总（d）109（WXV样V样总）T=1299AW（3）按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmo1的NADH定义为一个酶活力单位。MDHm（nmo1minIO4ce11）=AAV反总（d）109（200OXV样V样总）T=0.65AV反总：反应体系总体积，21041；:NADH摩尔消光系数，6.221031/mo1/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.005m1；V样总：加入提取液体积，0.202m1；T：反应时间，1min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；2000：细胞或细菌总数，2000万。b用96孔板测

6、定的计算公式如下（1）按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmo1的NADH定义为一个酶活力单位。MDHm（nmo1/min/mgprot）=AAXV反总（d）x1（）9（V样XCPr）T=12860AACpr（2）按样本鲜重计算：单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmo1的NADH定义为一个酶活力单位。MDHm（nmo1/min/g鲜重）=AAV反总（d）109（WXV样V样总）T=2598AW（3）按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmo1的NADH定义为一个酶活力单位。MDHm（nmo1min104ce11）=AAV反总（d）109（200OXV样V样总）T=1.3AV反总:反应体系总体积，210-41;:NADH摩尔消光系数，6.221031mo1cm;d：96孔板光径,0.5cm；V样：加入样本体积，0.005m1；V样总：加入提取液体积，0.202m1；T：反应时间，1min：W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；2000：细胞或细菌总数，2000万。优利4（上海）生酣目字自根