医学Western blot（细胞蛋白）.docx

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1、Western blot （细胞蛋白）1 .取细胞：若细胞为贴壁细胞，先将细胞用胰酶消化下来（至L5ml EP管）；若为悬浮细胞，可直接抽取一部分细胞至EP管，离心（我们实验室小离心机4500rpm, 5min,具体可调节），去上清。2 .洗：加ImlPBS充分混匀，离心（同上，具体可调节），去上清。3 .裂解：加 80T20ul 裂解液（RIPA:PMSF： COCK TAIL=100:1:1）,充分混匀，冰上裂解30mino4 .离：12000rmp,4, 10mino 将上清转移至另一 L5ml EP 管。5 .定量（BCA法）6 .加蛋白上样缓冲液（5X）,即步骤三所加裂解液的量4二所

2、加蛋白上样缓冲液的量。充分混匀。7 .沸水煮lOmin,取出冷却4,可放-20保存。8 .配胶：先配下层胶，按需求选择板子（1.0或1.5）,配完立即加无水乙醇等待30min凝（天冷时间可延长）。上层胶，配完立即插梳子等20-30min （天冷时间可延长）。9 .加样 第一孔加marker （3. 5-4ul）第二孔以后加样品，最后一个可再加marker（1.5-2. OuD&B：在电泳液中加样；电压80V. 30min,等到在压缩胶的作用下，处于同一水平线或看到marker红蓝分离，可调电压至120v （40-50min） 0电泳液是IX SDSo10 .切胶 根据因子分子量（可扩大切胶范围，以防出现误差）11 .转膜 海绵用遇冷的转膜液浸湿，PDF膜用甲醇激活lmin.放置顺序海绵-膜-胶-海绵-电极板,注：赶气泡,然后通电12 .封闭5%脱脂奶粉（比如称0. 5g奶粉，取10ml IX TBST） 2h.然后IX TBST洗13.孵育一抗，摇30min-lh后放4冰箱过夜。14 .回收一抗，IX TBST洗膜，洗3次，lOmin/次，转速130左右15 .孵育二抗2h 2ml左右（转速70）16 .回收二抗TBST洗膜，洗3次，10min/次17 .显影（1:1）,每个膜2001d左右