2023嗜酸性粒细胞直接计数方法.docx

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1、2023嗜酸性粒细胞直接计数方法一、原理用嗜酸粒细胞稀释液将全血稀释一定倍数，并破坏红细胞和大部分其他白细胞，使嗜酸粒细胞颗粒着色，混匀后滴入血细胞计数板内，计数一定范围内嗜酸粒细胞数，可换算为单位体积即每升血液中嗜酸粒细胞数。二、器材与试剂1、器材：显微镜、血细胞计数板及专用血盖片、试管、1OmI刻度吸管吸耳球、一次性微量吸管、乳胶吸头、末梢血用器材和消毒剂、医用棉签或优质卫生纸。2、试剂：常用的嗜酸粒细胞计数稀释液有以下几种。(I)HinkeIman稀释液：伊红0.2g,95%苯酚0.5m1,40%甲醛0.5m1,蒸留水加至IOOmI。(2)；臭甲酚紫稀释液：漠甲酚紫25.0mg,磷酸盐缓

2、冲液(0.1mo11zpH7.4)1.0m1蒸储水加至50.0m1o该稀释液为低渗溶液,能使红细胞和其他白细胞溶解。嗜酸性颗粒为非水溶性,因此不被溶解。浪甲酚紫为指示剂，使嗜酸颗粒显紫色，便于识别。少量磷酸盐缓冲液可缓冲澳甲酚紫中的游离酸。乙醇-伊红稀释液：95%乙醇30m1,甘油IomI,碳酸钾1Og,柠檬酸钠0.5g,20g1伊红液IomI。乙酸为嗜酸粒细胞保护剂，甘油可防止乙醇挥发，碳酸钾促使红细胞和其他白细胞溶解破坏，并增强嗜酸粒细胞着色。柠檬酸钠是抗凝剂。伊红是嗜酸性染料,可使嗜酸颗粒着红色。本配方嗜酸粒细胞着色鲜明，缺点是稀释液中含有较黏稠的甘油，细胞不易混匀，故需要计数前必须充分

3、振摇。3、标本：EDTA盐抗凝静脉血或末梢血三、操作步骤1、加稀释液：取小试管1支,加入嗜酸粒细胞稀释液0.38m1。2、采血用75%（VV）乙醇将左手环指指端皮肤消毒,待乙醇挥发干燥后,用一次性采血针穿刺，使血液自然流出，弃去第一滴血，再用一次性微量吸管准确吸取毛细血管血液201o或直接用EDTA盐抗凝血。3、稀释血液：用棉签或软纸擦去微量吸管管外余血，将其插入稀释液底部，缓缓放出血液，再吸取上层稀释液吸洗微量吸管23次，混细胞悬液室温静置。待红细胞被完全溶解。4、充池：轻微振荡试管，将细胞悬液充分混匀，用微量吸管吸取细胞悬液151左右,充人清洁而干燥的计数室内，静置23min,待细胞完全下

4、沉到计数池的底面时，于显微镜下进行计数。5、计数：低倍镜下（必要时用高倍镜）计数两个计数池中（中央及四角5个大方格)10个大方格内嗜酸粒细胞数，计数原则同红细胞计数。根据所用稀释液不同，嗜酸粒细胞颗粒可染成不同颜色。三种稀释液处理血标本后，高倍镜下(X40倍物镜)嗜酸粒细胞的形态特征。6、计算：嗜酸性粒细胞/1=(10个大方格内的嗜酸粒细胞10x20x106)/107、结果：报告嗜酸粒细胞*1091o8、参考区间：(0.020.52)1091o四、注意事项1、器材:本试验要求各种用具清洁,否则将影响嗜酸性粒细胞着色计数。2、稀释液：(1)嗜酸粒细胞直接计数法中所用稀释液种类繁多，虽配方不同，但

5、作用大同小异，分为保护嗜酸粒细胞而破坏其他细胞的物质(如乙醇丙酮等)和使酸粒细胞颗粒着色的物质(如溪甲酚紫、伊红、石楠红等)(2)Hinke1man液是较为理想的稀释液，它可以在室温中保存较长的时间。(3)其他配方中凡含有挥发性药物如乙醇、丙酮等试剂者，其保存时间均不宜太长并注意密封。(4)因乙醇、丙酮具有挥发性，如用此配方最好新鲜配制效果好最好每周配一次。(5)试剂应在操作前加入试管并及时测定，否则也会因挥发而影响结果。(6)若嗜酸粒细胞被破坏，可在稀释液中适当增加乙醇、丙酮等保护剂的用量，相反，中性粒细胞破坏不全，可适当减少保护剂的量，调整后重新采血计数。3、血标本采集：观察嗜酸粒细胞计数的变化，采集血标本时间应力求统-,以免受日间生理变化的影响。4、血液稀释：血液稀释后应及时混匀，因嗜酸粒细胞在稀释液中容易发生聚集，但不宜用力振荡，以免嗜酸粒细胞破碎。血液稀释后应在3060min内计数完毕,否则嗜酸粒细胞会逐渐溶解破坏，使计数结果偏低，且不易识别。5、细胞鉴别注意与残留的中性粒细胞区别，以免认错后使结果偏高。中性粒细胞一般不着色，但也有着浅红色的，但其颗粒较小。