2023蛋白质组学技术在弱精子症中的应用进展.docx

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1、2023蛋白质组学技术在弱精子症中的应用进展摘要弱精子症是一种精子运动活力不足的病症，约有27.8%的男性不育由弱精子症导致，其病因复杂，发病机制尚不明确，探讨其发病机制有助于寻找有效预防和治疗策略。近年来，随着蛋白质组学技术（双向电泳、酵母双杂交技术、质谱等技术）的发展，众多研究者将研究重点放在基于蛋白质组学的弱精子症研究上，揭示了弱精子症差异蛋白及所在生物通路，为弱精子症的机制研究提供了众多理论支撑。本文围绕蛋白质组学的相关技术，对弱精子症的差异蛋白表达、病因和发生机制等方面取得的诸多成果进行综述，希望为弱精子症的诊治提供新思路。蛋白质间的相互作用和通路及代谢异常为研究弱精子症的精子运动活

2、力提供了一个很有潜力的方向。【关键词】弱精子症；蛋白质组学；电泳，凝胶，双向；酵母双杂交；色谱；质谱；生物信息学；发生机制目前全球面临不育不孕问题的夫妻占比约五分之一1,且这一数字呈逐年升高趋势。其中由男性引起的不育不孕约占50%,常见原因诸如精液质量欠佳、精子活力下降、功能受损，但是其发病机制未明，治疗效果欠佳。尤以弱精子症常见，占男性不育原因的27.8%弱精子症是一种精子运动活力低下的病症。根据世界卫生组纨Wor1dHea1thOrganizationzWH0）第五版诊断准则，弱精子症是指精液参数中前向运动(progressivemoti1ity,PR)的精子率小于32%的病症21其病因和

3、病理复杂多样,以生殖道感染、免疫因素、精索静脉曲张、射精管梗阻、遗传因素等为主要原因，环境因素、生活习惯、全身性疾病及其他因素对精子活力也有一定影响3,确切地发病机制目前尚不明确。弱精子症在细胞遗传学方面的研究主要集中在染色体异常及核型分析等方面4-6o但受制于目前的技术，一些插入或者缺失、拷贝数重复大的序列难以检测，因此存在一定的局限性。弱精子症在基因方面的研究主要集中在基因多态性、分子标志物、拷贝数变异、免疫异常、基因突变筛查等方面7-9Jo目前因为基因技术成本过高、基因的选择性表达和多态性等自身原因，弱精子症发病机制在基因组学层面的研究尚无重大突破。随着蛋白质组学的逐步发展以及生物信息学

4、技术和相关数据库的快速崛起，蛋白质组学技术也逐渐被用于弱精子症的机制研究中，为弱精子症的诊断和治疗提供了新思路、新技术。一.弱精子症的蛋白质组学研究蛋白质组的概念最早由WiIkinS等10提出，是蛋白质和基因组的结合。蛋白质组学以蛋白质组为研究对象，探索蛋白质的表达、结构、功能、相互作用和修饰，以研究其结构和功能m随着蛋白的分离、鉴定等相关技术和生物信息学的进一步开发与完善，蛋白质组学在弱精子症方面的研究应用也越来越广泛，对疾病的早期诊断、进展监测及预后判断有重要的指导意义。下面将对弱精子症中应用到的蛋白质组学方法进行阐述，相关方法的原理、优缺点、特点总结见表1。1 *1Iif白质组学方法原理

5、、优缺点、特点对比2 .双向电泳（two-dimensiona1e1ectrophoresis,2-DE）:2-DE是等电聚焦电泳和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecy1su1fatepo1yacry1amidege1e1ectrophoresis,SDS-PAGE粕结合技术，先是通过pH值将蛋白质梯度分离至各等电点，随后再根据相对分子质量的大小进行分离，最终获得二维分布的蛋白质电泳图。双向电泳是蛋白质测定和分析的经典技术，具有高分辨率和高敏感度的优势，且能从整体水平反映精子蛋白组分，为揭示弱精子症病因的分子表型及分析机制提供了必不可少的技术支撑。作为蛋白质组学的发展核心

6、，它广泛应用于疾病蛋白质检测及成分分析上。在对弱精子症的研究中，双向电泳技术结合了计算机图像分析、大数据处理，在充实弱精子症蛋白质水平的病因及机制研究的基础上，更加完善了蛋白质图谱中相关机制。有研究通过2-DE技术在精子活力正常与弱精子症精浆中筛选差异蛋白，建立了2-DE图谱，结果显示健康对照与弱精子症患者的精浆中存在42个差异蛋白,并初次发现弱精子症的3个蛋白缺失点(Ran-特异GTP酶活化蛋白、泛素类似蛋白3前体、载脂蛋白A-II前体)以及3个特异表达的蛋白点COMM区域结合蛋白10、精眯/亚精胺N(I)-乙酰转移酶2、瘙痒症应答蛋白1前体12oBoi1ard等13通过牛精子与重组GRP7

7、8蛋白共孵育实验及双向电泳法，检测到特发性弱精子症患者存在差异表达的蛋白质(乳铁蛋白、SPANXBxGRP78、PGK2等)，丰富了弱精子症蛋白质数据库的内容，为深入研究人弱精子症提供了依据。申树林等14为探索人类弱精子症患者和精子活力正常人群精液中GRP78的表达差异,利用2-DE及WeStem-b1otting共同得出GRP78在精子活力正常人群的精子蛋白中高表达，表达倍数比弱精子症高2倍左右,提示GRP78的下调跟精子活力的调节息息相关，为临床诊断弱精子症提供了新的研究方向。2-DE在分离具有极端分子量、P1或疏水性的蛋白质时具有部分局限性。目前对于蛋白质的研究从原先的单个蛋白质扩展为蛋

8、白质间相互作用、翻译后修饰等方面。3 .酵母双杂交技术：酵母双杂交系统是根据真核转录调控创建，其原理是将两种待测蛋白质分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子(如GA14等)的DNA结合结构域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和转录激活域(activationdomain,AD)上，形成融合表达载体后通过对表达产物的分析进行相互作用蛋白的筛选、验证及机理探讨。酵母双杂交技术是真核生物调控转录起始过程的理论基础。近年来在研究抗原抗体互作、新蛋白功能探究及药物作用位点筛选等方面应用广泛，具有敏感度高、操作简便等优点。Freitas等15利用酵母双杂交技术和免疫共沉淀(co-immuno

9、precipitationzCo-IP)共同探究蛋白质之间的相互作用，揭示了精子运动分子机制中的新潜在蛋白糖原合成酶激酶-3(g1ycogensynthasekinase-3,GSK-3)z并提出GSK3A的相互作用物可能的非活性丝氨酸蛋白酶37(probab1einactiveserineprotease37,PRS37)可能参与精子运动。关注蛋白质之间的相互作用并构建蛋白质相互作用网络可为弱精子症病理机制的研究提供新思路。4 .质谱：质谱可以帮助确定样品的相对分子质量及组成成分，其基本原理是利用电场和磁场将进入质量分析器的试样中各组分电离产生的离子进行色散后分别聚集得到质谱图，从而确定其质

10、量。它特异性高，但敏感度受样本影响较大。色谱技术主要包含液相色课1iquidchromatography,1C)、气相色谱(gaschromatography,GC)等技术，具有成本低、分离度高、多种可选分离模式等优点，已成为众多研究者在蛋白质组学中选择的工具。研究者们为提高质谱敏感度，通常将质谱与其他技术结合进行学术研究。如1C、GC等技术结合,极大地推进了弱精子症的研究进展。目前高效液相色谱技术(highperformance1iquidchromatography,HP1C)成为蛋白质组学技术中的核心和热点技术，在弱精子症的研究中有广泛应用，为蛋白质及其翻译后修饰的鉴定和分析提供了良好的

11、硬件支持。1i等16通过HP1C分析精浆中的游离左旋肉碱，结果表明精浆游离1-肉碱水平的测定可作为一种潜在的生育力生化指标。1aZZarin。翱17使用HP1C得出与氧化还原能量状态、抗氧化防御、氧化/亚硝化应激、瞟聆、I1密咤和能量代谢有关的化合物，可能是有效评估弱精子症的实验室指标。这引发了对于弱精子症病因及发病机制在分子层面的思考，氧化还原反应相关酶的变化诱发弱精子症的发生发展，还需进一步探索和研究。Murdica等18探究了弱精子症患者精浆中外泌体的蛋白质组学差异,显示硒相关蛋白可能与精子成熟及运动机制密切相关。上述研究提示我们可以将代谢异常的化合物与弱精子症结合起来分析，进一步研究其

12、对临床治疗的意义，以探究其对精子活力的影响。陈厚仰19基于液相色谱-质谱联用分析结合免疫共沉淀结果提示TDRG1与CATSPER1存在的相互作用或是TDRG1在弱精子症中的具体作用机制的前提。目前随着色谱及质谱技术的快速发展，基于离子质荷比、离子峰强度和保留时间3个维度进行的3D蛋白质组学逐渐成为该领域热门的研究方法,它采取液相色谱和质谱并联合定量技术如细胞培养条件下稳定同位素标记技术(stab1eisotope1abe1ingtechniqueince11cu1ture,SI1AC同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforre1ativeandabso1utequantitat

13、ion,iTRAQ)技术、连续窗口采集所有理论光谱(sequentia1windowacquisitionofa11theoretica1spectra,SWATH)技术和非标定量法等的方法，更好地服务于蛋白质组学的研究中。牛鑫20和石理华等21通过二维液相色谱串联质谱(twodimensiona11iquidchromatographytandemmassspectrometry,1C-MS/MS)联用串联质量标签(tandemmasstag,TMT)标记或相对和绝对定量的等压标签(isobarictagsforre1ativeandabso1utequantitation,iTRAQ)标记

14、技术得出，在弱精子症患者精液中部分蛋白质表达异常，其中以蛋白质数量降低为主，其变化幅度与疾病严重程度密切相关。Amara1等22为探索人类精子活力缺陷有关的蛋白质，通过TMT蛋白标记和1C-MS/MS得出几种代谢途径有助于调节精子活力,尤以包括糖酵解在内的生物代谢途径最为重要。王轶等23应用iTRAQ方法探索特发性弱精子症精浆中的差异蛋白表达情况，结果显示差异蛋白NF2、SNX12下调超过2倍。PannerSe1vam等24采用1C-MS/MS得出与弱精子症生殖功能有关的一些关键蛋白(CCT3、ATP1AATP5A1和UQCRC2)下调。Parte等25通过纳米超高效液相色谱-质谱联用(u1t

15、raperformance1iquidchromatography-massspectrometrytandem,UP1e-MSE),得出老年男性精子和年轻弱精子症患者精子中PATE1均呈下降，或可作为评估精子活力及质量的潜在生物标志物。Chen等26采用WeStemb1otting和免疫荧光法得出弱精子症患者精子中TDRG1的水平显著低于正常精子症患者，且与精子活力呈正相关，同时使用1abe1-Free方法检测与TDRG1相关相互作用蛋白质。蒋丹丹等27根据TMT技术筛选少弱精子症患者精子差异蛋白,进而对蛋白进行验证得出Cu-ZnSOD和GSS的含量降低与精子质量改变相关，可作为少弱精子症的

16、候选标志物。以上研究得出弱精子症差异蛋白的种类、数量变化、蛋白缺陷、代谢途径等与弱精子症的发生发展及疾病严重程度密切相关。从蛋白种类和量的角度为诊断弱精子症提供了基础理论支持。研究弱精子症与蛋白质翻译后修饰之间的关系以及蛋白质相互作用可能为后续研究精子运动的分子理论以及该疾病的靶向临床治疗提供新思路。随着软电离技术的产生和应用，基质辅助激光解吸离子化技术(matrix-assisted1aserdesorptionionizationmassspectrometry,MA1DI-MS)的迅速发展,其本质是在气相中利用脉冲激光电离基质分子,将质子转移到已被脉冲激光电离气化的样品分子上进行质谱分析。由于基质吸收了大部分激光能量，可保证样品分子只产生准分子离子，且脉冲激光电离具有作用时间短和温度低的优势，从而减少了热分解，被普遍应用于蛋白质、核酸等生物大分子的相对分子质量测定和分析中。1iU等28通过基质辅助激光解吸电离串联飞行时间