感受态细胞的制备及各种转化方法比较.docx

《感受态细胞的制备及各种转化方法比较.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《感受态细胞的制备及各种转化方法比较.docx（3页珍藏版）》请在第一文库网上搜索。

1、感受态细胞的制备及各种转化方法1大肠杆菌感受态细胞的制备(CaC2法)(1)从新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一单菌落，接种于35ml LB液体培养中，37C振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:1001:50转接于100ml LB液体培养基中，37振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次OD600nm,至 OD600nmS0.5 时停止培养；(2)每组取培养液3个2ml转入2ml离心管中，在冰上冷却20-30min,于4, 4000rmin离心l()min (从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳)；(3)倒净上清培养液，用1ml冰冷的

2、().lmol LCaCb溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；(4) 04, 4000r / min 离心 lOmin；(5)弃去上清液，加入500ll冰冷的0.1molL CaCb溶液，小心悬浮细胞。04,4000r / min 离心 lOmin；(6)弃去上清液，加入l()()l冰冷的().lmol LCaCb溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；(7)制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15%左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于.70条件下，可保存半年至一年。2细胞转化(1)分别取3个100l感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后

3、马上进行下面的操作)，第一组，加入10l重组质粒DNA(体积不超过10l) 100l感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，插入DNA片段对照组，即酶切后DNA片段25ng 100l感受态细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，即1ng未酶切pBluescript质粒DNA十100l感受态细胞悬液。(2)将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置2030min,于42水浴中保温1-2min,然后迅速冰上冷却2min(3)立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体培养基(不需在冰上操作)，使总体积到0.5ml,该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37C振荡培养约45-60min ,使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体

4、表达抗生素基因产物(Ampr)。3平板培养(有时需要稀释)(1)取各样品培养液0.1ml,分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀(如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫)。(2)菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37C恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。用CaC2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5x106-2x107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。4）检出转化体和计算转化率统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养Jl内菌落生长状况应如表所示:各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析蛆含抗菌素的平板结果说明转化实验组白色菌落和少量蓝色菌落说明有重组质粒导入细胞中（有时还需要随切进一步鉴定）插入DNA）段对照组无菌落或极少量白色菌落说明插入片段比较纯或有少量模板DAN存在质粒对照蛆蓝色菌落可以判断感受态细胞的效率转化体总数=菌落数 （转化反应原液总体积/涂板菌液体积）插入频率=蓝色菌落数/白色菌落数转化频率=转化体总数/加入质粒DNA的量（计算出每微克的转化菌落数）