国内外的黄曲霉毒素测定法.docx

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1、国内外的黄曲霉毒素测定法黄曲霉毒素具有较强的毒害作用，可诱发肝、肾、肺、胃等部位的癌变，黄曲霉毒素B1被公认为是目前致癌力最强的天然物质。药材、饮片及制剂在贮藏、制备、运输过程中，如保存不当，就会有受潮霉变而污染黄曲霉毒素的可能。因此，各药典都将黄曲霉毒素列为很重要的安全性指标，中国药典和欧洲药典对多种中药材都都建立了黄曲霉素检查指标，美国药典对植源性的药品也要求检查黄曲霉毒素。、比较中国药典、美国药典、欧洲药典的检查方法各药典中方法号、限度、适用范围等列表如下，由此可见,各药典收载的检测方法不同、限度不同，最严格的当属欧洲药典。中国药典美国药典H欧洲药典通则2351真菌毒素测定法GENERA

2、1CHAPTERSArtic1esofbotanica1orIGIN2.8.Isdeterminationofaf1atoxinbiinhiRUGSHP1C法T1C法HP1C法HP1C-MS法薄层扫描法酶联免疫法HP1C法每IOOOg含黄曲霉毒素B1不得过5g，总量不得过10go每IOOOg含黄曲霉毒素B1不得过5g,总量不得过20go每IoOog含黄曲霉毒素B1不得过2g,得过4go中国药典的三种方法都可以使首先使用第一法，第一法系统适用性不通过才会使用第二法或第三法。只有一种方法，适用于devi1,sc1awroot,gingerandsennapods,用一品种需要验证适用性。用，当测定

3、结果超出限度时，采用第二法进行确认。注：总量为黄曲霉毒素B1(AFB1),黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)和黄曲霉毒素G2(AFG2)的总量。2、详解中国药典、美国药典、欧洲药典的HP1C方法黄曲霉毒素检查方法中，唯一同时适用于三家药典的方法，只有HP1C法(荧光检测器)，而且光化学检测器与HP1C-荧光检测器配套使用，在线对黄曲霉毒素B1、GI进行衍生，不需要任何化学试剂，应用范围较广，因此本文重点比较此法在各药典中的异同。从以下几部分可以看出，色谱柱、流动相、流速、波长、供试品和对照品的配制方法、进样量等内容都存在较大差异，需要谨慎对照使用。本文详细写出了USP中的几

4、种测定方法。2.1中国药典中黄曲霉毒素检查方法(HP1C法)具体内容验方法也谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂泳动相甲醇-乙睛-水（40：18:42）速1.0m1min后衍生化光化学衍生器（254nm）测器荧光检测器，激发波长36OnnI（或365nm）,发射波长450nmo统适用性两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5；需确认回收率应在60120%,线性回归的相关系数应不低于0.990；能合对照品溶液精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1、B2、GkG2标示浓度分别为1o11g/m1、0.3g/m11.0g/m1、0.3g/m1）0.5m1,置10m1量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶

5、液。精密量取贮备溶液1m1,置25m1量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。夕试品溶液取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，置于均质瓶中，加入氯化钠3g,精密加入70%甲醇溶液75m1,高速搅拌2分钟（搅拌速度大于I1OOOrmin）,离心5分钟（离心速度4000rmin）,精密量取上清液15m1,置50m1量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，离心10分钟（离心速度4000rmin）,精密量取上清液20m1,通过免疫亲合柱，流速每分钟3m1,用水20m1洗脱（必要时可以先用淋洗缓冲液IOnI1洗脱，再用水IOnII洗脱），弃去洗脱液，使空气进人柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2m

6、1量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22m）滤过，取续滤液，即得。登样量混合对照品溶液51、101、151、201、251；供试品溶液2050Io量方法测定各对照品溶液的峰面积，以峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标，绘制标准曲线；测定供试品溶液的峰面积，从标准曲线上读出供试品中黄曲霉毒素B1B2、G1G2的量，并计算出四者总和。2.2美国药典中黄曲霉毒素检查方法（HP1C法）检验方具体内容法色谱柱4.6-mm15cm,3-m填料11（即十八烷基硅烷键合硅胶）流动相水-甲醇-乙睛（60:25：15）流速0.8m1min检测器荧光检测器，激发波长362nm,发射波长440nm系统适用性

7、洗脱顺序为AFG2、AFG1AFB2和AFB1；将5号线性对照溶液5m1加入到5g的样品中，按“供试品溶液“（甲醇-0.5%碳酸氢钠（7:3）用量为20m1）处理方法，计算AFB1（2gkg）和黄曲霉毒素（5gkg）的平均回收率，应分别不低于68%和70%。AFB1和黄曲霉毒素总量的相对标准偏差（RSD）不高于10%o免疫亲和柱预处理免疫黄曲霉素柱的总黄曲霉毒素最小容量不低于IOOngo将AFB1AFB2、AFG1和AFG2每个5ng,溶于IOnI110%甲醇的磷酸盐缓冲盐溶液（vv）中时，各回收率不低于80%o对照品溶液用乙膈制备AFB1AFB2、AFG1和AFG2分别含有2.0、0.50、

8、2.0和0.50gm1的混合对照溶液。首先用乙睛制备标示浓度均为IOHg/m1的各储备液，在36Onm附近测定最大吸光度，计算公式为：黄曲霉毒素浓度（gm1）=（AXMrX1OOO）/,其中A为吸光度，Mr为分子量，为摩尔吸收系数，见附表1。准确量取一定量黄曲霉毒素各储备液至同一容量瓶，用乙聘稀释至规定浓度。冰箱储存，使用前平衡至室温。用甲醇-水（1:1）稀释黄曲霉素对照溶液，最终浓度见附表2o冰箱保存，使用前平衡至室温，每日新制。伊试品溶液取样品5g,置于50m1离心管中，加入氯化钠Ig和甲醇-0.5%碳酸氢钠（7:3）25m1o在涡流混合器上混合，直到样品颗粒和提取溶剂充分混合，40OrP

9、nI振摇10min,7000rpm离心IOmin,立即取7m1至50m1离心管中，加入0.IM磷酸盐缓冲溶液28m1,混合，过滤，收集25m1滤液（相当于Ig样品）到25m1刻度量筒中，并立即上IAC柱。注：对于IAC柱在使用前必须在室温下至少平衡15分钟。从小柱上取下顶盖，并将其与储液罐连接。从柱上拆下端盖，并将其连接到柱歧管上（必须拧紧）。让柱中的液体通过，直到液体高出柱床约23mm。将滤液25m1倒入储液罐。让液体自然流过柱子，让柱子流干。为了便于再次开始流动，从歧管上取下色谱柱，向柱中加入磷酸盐缓冲盐溶液约2m1,将色谱柱重新连接到储液罐上，然后用磷酸盐缓冲盐溶液3m1和水5m1清洗色

10、谱柱(如果使用其他技术去除柱末端的气泡并很容易重新开始流动，则可将磷酸盐缓冲盐溶液5m1直接加入到柱储液罐中)。让柱子流干，然后用注射器注入3m1空气通过柱子，用甲醇In1I洗脱，并用3m1容量瓶中收集洗脱液，使洗脱液自由滴落。让柱子流干。静置1分钟，然后用额外的甲醇InII洗脱，并收集在同一容量瓶中。让柱子流干，并注入IOm1空气通过柱子，用水稀释洗脱液至刻度，立即进行分析。这样量501淀量方法毒素(gkg)=(R-a)SVWFR=样品溶液的峰面积；a二校准曲线的y截距；S二校准曲线的斜率；V=样品溶液的最终体积(m1)；W二通过免疫柱的供试品1g;F二稀释系数，V=3n1时为1；黄曲霉毒素

11、的总量是AFG1AFG2、AFB1和AFB2的总和。2.3欧洲药典中黄曲霉毒素检查方法(HP1C法)检验方法具体内容色谱柱柱长0.25m,直径4.6mm,十八烷基硅烷键合硅胶为固定相(5-m)济动相乙膈-甲醇-水(2:3:6)漆速1.Om1min后衍生化光化学衍生器(254nm)桧测器荧光检测器检测，激发波长=365nm,发射波长Aem=435nmo系统适用性出峰顺序：G2、GKB2、B1；需满足验证要求。对照品溶液用甲苯-乙膈(98：2)制备10g/m1AFB1贮备溶液，并在33Onnr370nm波长范围内测定吸收曲线，计算公式为：黄曲霉毒素浓度(|1gm1)=(AM100)/,其中A为紫外

12、吸收曲线上的最大吸光度，M为B1的分子量(312gmo1),为摩尔吸收系数(1930m2mo1)。用甲苯-乙膈(98:2)将初级贮备液稀释为100ngm1的次级贮备液，用铝箔紧密包好后，置于4。C储存，使用前，待溶液恢复至室温后才能取下铝箔。使用前后记录容量瓶的重量。按附表3制备系列对照溶液，将所需体积的次级贮备液置于25OnI1容量瓶中，氮气吹干，加入甲醇75m1溶解黄曲霉毒素B1,并用水稀释至刻度。戈疫亲和柱预处理免疫亲和柱对黄曲霉毒素B1的容量不低于IOOngo将AFB15ng,溶于12.5m1甲醇和87.5m1水中时，回收率不低于80沆使用前平衡至室温。试品溶液取本品粉末5.OOg,加

13、入甲醇：水(70:30)混合溶液IOOm1,超声处理30min,取滤液IOm1至15OnI1锥形瓶，并加入水70m1。取40m1以流速3m1min(不得超过5m1min)通过免疫亲和柱。用水以流速5m1min冲洗小柱两次，每次IOm1用注射器注入空气10s。取甲醇5m1注入小柱，并保持自然流出，收集洗脱液至5m1容量瓶中，Imin后，注入甲醇0.5m1,再隔InIin后，注入甲醇0.5m1,每次加入甲醇后，均通过注入空气收集洗脱液，用水稀释至容量瓶刻度，摇匀。溶液澄清的话，可直接用于分析；否则应过滤处理，并确保黄曲霉毒素没有损失。助样量5001兵量方法用黄曲霉毒素B1系列对照溶液5做标准曲线，

14、样品浓度超出线性范围，则需要做相应稀释。毒素(gkg)=(R-b)aV/WR=样品溶液的峰面积；b二校准曲线的截距；a二校准曲线的斜率；V稀释倍数；W=通过免疫柱的供试品g；黄曲霉毒素的总量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的总和。2.4上述方法中的三个附表附表1黄曲霉毒素M溶剂AFB1312乙庸20700AFB2314乙聘22500AFG1328乙晴17600AFG233乙揩18900附表2号黄曲霉素对照溶液加入量黄曲霉素工作对照溶液（ngm1）AFB1AFB2AFG1AFG2总和00000012.50.250.06250.250.06250.625250.50.1250.50.1251.255010.10.22525.5IOO20.520.55200414110附表3系列对照溶液加入次级贮备液的体积(D对照溶液的最终浓度(ngm1)11250.0522500.135000.247500.3510000.43、注意事项由于黄曲霉毒素的毒性，实验过程必须小心谨慎，小编总结出