蔗糖磷酸合成酶SucrosephosphatesynthaseSPS试剂盒说明书.docx
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1、蔗糖磷酸合成酶(Sucrosephosphatesynthase,SPS)试剂盒说明书微量法100管748样注意:正式测定管前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定渊定意义:蔗糖不仅是重要的光合产物,也是植物体内运输的主要物质,还是碳水化合物的贮存形式之一。SPS(EC2.4.1.14)以果糖6磷酸为受体,形成的蔗糖磷酸在蔗糖磷酸酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径。渊定原理:蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸,蔗糖磷酸与间苯二酚反应可呈现颜色变化,在480nm下有特征吸收峰,酶活力大小与颜色的深浅成正比。需自备的的仪藉和用品:可见分光
2、光度计/酷标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿/为孔板、研钵、冰试剂的组成和配制:提取液:液体IOom1X1瓶,4C保存;试剂一:液体2.5m1x1瓶,-20C保存;试剂二:1000gm1蔗糖溶液IOm1X1瓶,4C保存;试剂三:液体2m1x1瓶,4C保存试剂四:液体25m11瓶,4保存;试剂五:液体6m1x1瓶,4避光保存;样品涌定的准备:按照组织质量(g):提取液体积(m1)为1:510的比例(建议称取约0.1g组织,加入Im1提取液),进行冰浴匀浆8000g4C离心IOmin,取上清,置冰上待测。测定步骤:1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至480nm,蒸饱水调零
3、。2、样本测定,(在EP管中依次加入下列试剂):试剂名称(1)测定管对照管标准管空白管样本1010蒸馀水454555试剂二10试剂一45混匀,25C准确水浴Iomin试剂三15151515沸水浴中煮沸Iomin左右(盖紧,以防止水分散失),冷却试剂四210210210210试剂五60606060混匀,沸水浴30min,冷却后,取2001至微量石英比色皿或96孔板中,48Onm下测定各管吸光值。标准管和空白管只要做一管。每个测定管需要设一个对照管。SPS活力单位的计算:1、按照蛋白浓度计算单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1g蔗糖定义为一个酶活力单位。SPS活性(gminmgprot)=C标准管xVx(A测定管-A对照管)(A标准管-A空白管)汽VIXCPrHT=IOOX(A测定管-A对照管)(A标准管-A空白管)Xr2、按照样本鲜重计算单位定义:每g组织每分钟催化产生1g蔗糖定义为一个酶活力单位。SPS活性(gming鲜重)=C标准管XVIX(A测定管-A对照管)(A标准管-A空白管)(WxV1V2)=100x(A测定管-A对照管)(A标准管-A空白管):WC标准管:标准管浓度,1000gm1;VI:加入反应体系中样本体积,0.01m1;V2:加入提取液体积,1m1;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/m1;W:样本鲜重,g;T:反应时间:1Omin0优利科(上海)生命科学再限X
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