脂蛋白酯酶LipoproteinlipaseLPL试剂盒说明书.docx

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1、脂蛋白酯酶（1ipoprotein1ipase,1P1）试剂盒说明书微法100T/48S注意：正式测定之前选择2.3个预期差异大的样本做预测定。测定意义：脂蛋白酯酶是脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、乳腺细胞及巨噬细胞等实质细胞合成的一种酶，可催化甘油三脂水解为脂肪酸和单酸甘油酯，以供组织氧化供能和贮存，并在不同的组织表现出不同的生理意义。测定原理：脂蛋白酯酶水解4硝基苯棕桐酸酯产生4-硝基苯酚，在400nm有特征吸收峰。自备实验用品及仪器：天平、冷冻离心机、研钵、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板。试剂组成和配制试剂一：液体105m11瓶,4保存。试剂二：液体4m1x瓶，

2、4避光保存。试剂三：液体IOm1x1瓶，4C保存。样品处理：1 .组织：按照质量（g）：试剂一体积（m1）为1：570的比例（建议称取约0.1g,加入Im1试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4*C,IOoOog离心IOmin,取上清待测。2 .细胞：按照细胞数量（IO4个）：试剂一体积（m1）为5001000:1的比例（建议500万细胞加入Im1试剂一加入试剂一，冰浴超声波破碎细胞（功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4C,IoOoog离心IOmin,取上清待测。3 .血清：直接测定。测定操作：对照管测定管样品（1）2020试剂一（1）80试剂二（1）80混匀，45水浴IO

3、min试剂三（1）100100充分混匀，25C静置2min,于微量石英比色皿/96孔板，测定400nm处吸光值，记为A对照管和A测定管，4A=A测定管-A对照管计算公式Ia.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线：y=0.058Ix-0.0169,R2=0.99821 .按照蛋白浓度计算薛活性定义：住45aC,pH7.5条件下，每亳克蛋白每分钟水解产生1mo14硝基苯酚为一个酶活力单位。1P1活性(mo1ZminZmgprot)=(A+0.0169)0.0581xV反总(V样XCPr)T=17.21(A+0.0169)Cpr2 .按照样本质量计算薛活性定义：在45C,pH7.5条件卜.，每

4、克组织每分钟水解产生1mo14硝基苯酚为一个衡活力单位。1P1活性(mo1ming鲜重)=(A+0.0169)O.O581xV反总(WXV样V样总)T=17.21(A+0.0169)W3 .按照细胞数量计算酶活性定义：在45C,pH7.5条件下，每IO4个细胞每分钟水解产生1mo14硝基苯酚为一个酶活力单位。1P1活性(mo1min104ce11)=(A+0.0169)O.O581xV反总(V样X细胞数量V样总)T=17.21(A+0.0169)细胞数量4 .按照液体体积计算酶活性定义：在45C,pH7.5条件下，每亳升血清每分钟水解产生1mo14-硝基苯酚为一个酶活力单位。1P1活性(mo1

5、minm1)=(A+0.0169)O.O581xV反总V样T=17.21(A+0.0169)V反总：反应总体积，0.2m1：V样：反应体系中加入样本体积，0.02m1；W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积,1m1；T：反应时间，IOminb.用96孔板测定的计算公式如下标准曲线：y=0.029x-0.0169,R2=0.99821 .按照蛋白浓度计算鲜活性定义：在45C,pH75条件下，每毫克蛋白每分钟水解产生1mo14-硝基苯酚为一个酶活力单位。1P1活性(mo1minmgprot)=(A+0.0169)0.029xV反总(V样XCPr)T=34.42(A+0.0169)Cpr2 .按照

6、样本质量计算障活性定义：在45C,pH7.5条件下，每克组织每分钟水解产生1mo14-硝基苯酚为一个酶活力单位。1P1活性(mo1ming鲜重)=(A+0.0169)0.029xV反总(WXV样V样总)T=34.42(A+0.0169)W3 .按照细胞数量计算酶活性定义：在45C,pH75条件下，每IO4个细胞每分钟水解产生1mo14-硝基苯酚为一个酶活力单位。1P1活性(mo1min104ce11)=(A+0.0169)0.029xV反总(V样X细胞数量V样总)T=34.42(A+O.OI69)细胞数量4 .按照液体体积计算解活性定义：在45C,pH7.5条件下，每毫升血清每分钟水解产生1mo14-硝基苯酚为一个酶活力单位。1P1活性(mo1minm1)=(A+0.0169)0.029xV反总V样T=34.42(A+0.0169)V反总：反应总体积，0.2m1；V样：反应体系中加入样本体积，0.02m1；W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积,1m1；T：反应时间，IOmin注意事项：1 .试剂三加入混匀后静置两分钟立即测定，否则影响吸光值。2 .吸光值过高或者测定结果不稳定，则将酶液进行适当的稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。