胞浆异柠檬酸脱氢酶ICDHc试剂盒说明书.docx

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1、胞浆异柠檬酸脱氢酶（ICDHc）试剂盒说明书微法100管用6样注意I正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定渊定意义：ICDHc（EC1.1.1.42）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化异柠椽酸脱氢脱按生成-酮戊二酸，同时还原NADP+生成NADPH,ICDHe是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种NADPH重要求源，在逆境中该醉活性通常会发生显著变化。渊定原理：利用ICDHc催化NADP+还原成NADPH反应，在340nm卜.测定NADPH浓度的增加。所需的仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水。

2、试剂的组成和配制：提取液：液体IOom1X1瓶，4C保存：试剂一：液体19m11瓶，4C保存；试剂二：粉剂1瓶，4保存；试剂三：粉剂X1瓶，-20保存；样本的前处理：1、细菌、细胞或组织样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（IO4个）：提取液体积（m1）为5001000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入Im1提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W,超声3s,间隔103,重复30次）；80g4C离心IOmir,取上清，置冰上待测。组织：按照组织质量（g）：提取液体积（m1）为1：510的比例（建议称取约0.1g组织，加入

3、Im1提取液），进行冰浴匀浆。8000g4C离心IOmin,取上清，置冰上待测。2、血清（浆）样品：直接检测。渊定步IIh1、分光光度计或衡标仪预热30min以上，调节波长至340nm,蒸储水调零。2、将试剂二和试剂三转移至试剂一中充分溶解；在37*C（哺乳动物）或25C（其它物种）水浴IOmin以上；用不完的试剂分装后20C保存，禁止反竟冻融。3、在微量石英比色皿或96孔板中加入101样本和1901试剂一，混匀后立即记录340nm处20s后吸光值AI和2min20s后的吸光值A2,计算AA=A2-A10注意事项：1、若A2-A1大于0.5,需将酶液用提取液稀释，使A2-A1小于0.5,可提高

4、检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。2、若A2-A1小于0.005,可延长反应时间到5min或IOrnirI。ICDHC活力单位的计算：a用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、血清(浆)ICDHC活力的计算：单位的定义：每m1血清(浆)每分钟生成InmO1NADPH定义为一个酶活力单位。ICDHc(nmo1minm1)=AAV反总子(d)1()9v样+=i608A2、组织、细菌或细胞中ICDHC活力的计算：(1)按样本蛋H浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmo1NADPH定义为一个酶活力单位。ICDHc(nmo1minmgprot)=AAV反总(d)X1o9(V样XCPr)

5、T=1608AACpr(2)按样本鲜重计尊：单位的定义：卷g组织每分钟生成1nmo1NADPH定义为一个酶活力单位。ICDHc(nmo1ming鲜重)=AAxV反总(d)109(WVWVT=1608AW(3)按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmo1的NADPH定义为一个酶活力单位。ICDHcnmo1min104)=AAV反总子(d)1()9(500V样V样总)T=3.216AAV反总:反应体系总体积,21041；:NADPH摩尔消光系数，6.221031/mo1/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01m1；V样总：加入提取液体积，1m1；T：

6、反应时间，2min：Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。b用96孔板测定的计算公式如下1、血清(浆)ICDHC活力的计算：单位的定义：每m1血清(浆)每分钟生成Inmo1NADPH定义为一个酶活力单位。ICDHcnmo1minm1)=AAV反总子(d)1()9v样+=3216A2、组织、细菌或细胞中ICDHe活力的计算：(1)按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmo1NADPH定义为一个酶活力单位。ICDHcnmo1minmgprot)=AAV反总(d)109(VtCpr)T=3216ACpr(2)按样本鲜重计算：单位

7、的定义：每g组织每分钟生成1nmo1NADPH定义为一个酶活力单位。ICDHc(nmo1ming鲜重)=AAV反总(d)1小(WXV样V样总)T=3216AW(3)按细菌或细胞密度计算：单位的定义：1万个细菌或细胞每分钟生成1nmo1的NADPH定义为一个酶活力单位。ICDHc(nmo1min104)=AAV反总(d)109(500V样V样总)T=6.432AAV反总：反应体系总体积,2x1。；:NADPH摩尔消光系数，6.221031/mo1/cm；d：96孔板光径,0.5cm；V样：加入样本体积，0.01m1；V样总：加入提取液体积，1m1；T：反应时间，2min：Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。优利科(上痔)生金租字也眼X回H湘鼻回