实验动物狂犬病病原检测.docx

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1、实验动物狂犬病病原检测一、原理在微孔板上预包被纯化狂犬病毒抗原，使免疫反应在固相载体上进行。当被检血清中有狂犬病病毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原抗体复合物，再与抗犬IgG酶标记物反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行定性检测。二、主要试剂和器材1、试剂：犬狂犬病毒IgG抗体检测试剂盒(定性)，包括： 预包被狂犬病毒抗原的微孔板； 狂犬病毒IgG标记物； 狂犬病毒IgG阳性对照； 狂犬病毒IgG临界对照； 狂犬病毒IgG阴性对照； 显色液A：磷酸氢钠-柠檬酸缓冲液(O.05mo11pH5.0)IooonI1,30%过氧化氢H202(MW340)3.5m1； 显色液B：柠檬酸105

2、2g,乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)0.186g四甲基联苯胺(TMB)O.25g,二甲基亚飒(DMSO)8.Om1纯化水992m1； 终止液:98%硫酸278m1纯化水972.2m1； 10倍浓缩洗涤液:PBS(0.1mo11pH7.27.4)995m1吐温-20.5m1； 样品稀释液：硼酸盐缓冲液(O.01mo11pH8.0)956.Om1,甘油(MW92.09)40.Om1,酪蛋白(casein)10%硫柳汞钠溶液2.Om1吐温-20,1.0m1,1%酚红溶液1omU 试剂在使用前应恢复至室温(18。C25七)。2、器材包括： 精密移液器101-IOOu1; 一次性移液器吸头； 振荡

3、器； 酶标仪(含450nm波长滤光片); 37。C恒温培养箱； 蒸锵水或去离子水； IoOm1量简； 离心机；吸水纸。三、检测1、样品的准备将采集到的待检犬血液样品离心，分离出待检犬血清或血浆。应避免使用染菌、溶血和高血脂的样品；室温保存样品不应超过8h,若试验在8h以后进行，需将样品保存在2。C1(C,如保存超过1周，则应保存在-20。C并避免反复冻融。2、试剂配置将10倍浓缩洗涤液恢复至室温并振摇然后用去离子水或蒸储水作10倍稀释。3、稀释样品将已分离好的犬血清或血浆用样品稀释液做1:10稀释，即取50U1血清或血浆加入到5001样品稀释液中，并充分混匀。4、加样取所需量的预包被微孔板条固

4、定于板架上，依次加入稀释好的样品，1001孔，然后将阳性、阴性对照各加1孔临界对照加3孔IOOU1/孔另留一孔不加样品作为空白对照，在记录纸上记录各样品和对照的次序或位置,剩余的板条放入密封袋中保存。5、孵育加样完成后用封板膜覆盖板条置37。C恒温培养箱中孵育30mino6、洗板甩净孔中液体拍于用稀释好的洗涤液加满每孔,停留InIin后甩净拍干，如此重复洗涤3次。7、加酶除空白对照外，其余各孔垂直滴加酶标记物1滴（50U1）置37恒温培养箱孵育30mino8、显色重复步骤6洗板3次拍干后每孔（含空白对照孔）垂直滴加显色液AB液各1滴，置37。C恒温培养箱避光显色IOmino9、终止每孔（含空白

5、对照孔）立即加入终止液1滴，混匀后以空白孔调零，用酶标仪450nm波长测定A值。四、结果判定1、试验结果符合下列条件方为有效：以空白孔调零阴性对照值小于等于0.10临界对照A值应在0.15-0.40之间证明试验成立。2、结果判定待检样品A值大于等于临界对照A值的平均值，判为阳性；待检样品A值小于临界对照A值的平均值，判为阴性。五、结果解释1、基础级犬：接种疫苗后，经E11SA检测抗体效价达到阳性值判为合格。2、SPF级犬不应进行疫苗接种，对阳性检测结果，选用同一种方法或另一种方法重试。如为阳性则判为阳性。3、基础级犬群体免疫抗体合格率：免疫抗体合格率二（被检动物抗体阳性数/被检动物总数）x100%基础级犬群体免疫抗体合格率达到70%以上可判为该犬群免疫合格。