PCR实验室学习资料.docx

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1、PCR实验室一、什么是PCr实验室：PCr实验室又叫基因扩增实验室。PCR是聚合酶链式反应(Po1ymeraSeChainReaCtiOn)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。通过DNA基因追踪系统，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别，精确检测乙肝病毒在患者体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否必要服药、肝功能有否异常改变能及时判断病人最适合使用哪类抗病毒药物、判断药物疗效如何、给临床治疗提供了可靠的检验依据二、开展Per实验室应具备的条件：1、必须拥有标准的的PCR荧光实验室；实时荧光定量PCR技术于1996

2、年由美国App1iedBiosystems公司推出由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍2、检测设备必须符合标准PCR荧光实验室设置要求；荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。3、必须通过国家临床检验中心的验收和认证；4、检测人员必须通过国家临检中心业务培训并取得合格证书；PCR实验室内工作人员必须参加由国家卫生部或各省临床检验中心举办的临床基因扩增培训班，并持证上岗。PCR

3、实验室通过验收，实验室至少必须应有两个以上持有“临床基因检测上岗证”。PCR实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序(SOP),建立系列质量管理文件等,确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行5、必须在无菌无尘环境下进行操作三、PCr实验室的功能：能够对患者病情进行科学、准确、实时的掌控，并结合抗HBV与T细胞免疫来打破免疫耐受，阻断肝病病毒复制的疗法、有效的分解肝炎病毒，解决了乙肝病毒易变异、耐药,病毒复制模板难以治疗，人体免疫耐受状态不易打破等医学难题，能迅速消除临床症状，而且有效抑制乙肝病毒复制，明显加快e抗原、抗

4、体的血清转换速度，杀灭血液及肝细胞内的病毒，为防止再感染提供了长期保护，有效阻断和逆转肝纤维化、肝硬化进程。四、怎样建立PCr实验室1、建立样品准备区这个区域专门用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施：（DPCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理，以根据应用的需要提取DNA或RNAo用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。（4）DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作，以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。管子打开前都要

5、简短离心以减少气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，这样会产生气溶胶。任何时候都应该穿实验服和带手套，手套要经常更换，尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间，经常清洗。2、样品准备和RNA-PCRRNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题，反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。3、建立前PCR区。该去专门用于准备各种反应，这个区域必须保持干净，而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备，特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。4、PCR实验室试剂的操作。

6、所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的一新鲜蒸储的去离子水，用0.22m过滤的，并且是高压灭菌。在20到25贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。所用试剂都应该以大体积配制，实验一下看试剂是否满意，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。5、在前PCR区建立PCR混合物。可以把即刻可用的“主

7、混合物”溶液配好、分装并保存在-20或4,在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。如果你的实验室使用多套引物，以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济，可以考虑分装保存够一天的PCR成分。作为一个规则，应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且，你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。阴性样品要与每组样品同时做，以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染，阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。（5）当做阳性对照时，有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。由于必须有

8、对照反应，对照模板的特点应该予以考虑。6、控制污染的方法。已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染一使用UNG,这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线，这种方法不能完全消除污染问题，但可以将污染降低几个数量级。7、PCR仪的位置8、后PCR区PCR完成以后，需要分析样品并解释数据,应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的，决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动PCR实验室实验室环境的科学性,不但决定操作人员的人身安全，同时也是实验成果可靠的必要保障。2002年国家

9、卫生部颂布临床基因扩增检验实验室基本设置标准，强调基因扩增检测实验必需在标准的PCR实验室内进行。经科学设计,标准施工的成套PCR实验室可有效避免实验过程中试剂、标本、扩增物以及操作人员的交叉污染,完全保证人员安全及实验数据可靠。群迈标准PCR实验室完全依据国家卫生部临床基因扩增检验实验室基本设置标准制作，产品包括：1 .硬体配制1）结构处理：严格按照生物安全标准，采用专业净化建材,室内所有阴角、阳角均采用圆弧处理，门窗等不同材料相接处采用弹性材料密封。从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题；2）控制部分：运用接触器的不同工作状态的信号输送,分别精密控制六套空气动力单元,三套气流系统,九套风量

10、调节器,及避逆流装置等,达到各功能区域的相对正压,负压.有效避免了PCR实验过程中的易发交叉污染,保证人员安全及实验数据可靠。3）独立三区：设置三个独立实验功能区域（试剂准备、标本制备、扩增及分析），专用净化传递窗达到人物分流；三区配备独立缓冲间，标识明确，流程清晰，确保应用者实验流程严密有序。2 .内部配制：灯具、插座、新风系统，控制，专用实验桌/椅等设备的设计，充分考虑PCR标准仪器设备摆放以及人员操作方案，保证PCR应用环境安全、紧凑、舒适。3 .可选配配制：本公司可提供更体贴的方案满足客户特殊标准1）结构可选：更高安全等级净化库板2）实验台可选：Wi1sonartEPOXY304不锈钢3）新风系统可选：加装专用空调、出风口高效单元组4 ）7900等大型PCR仪大功率供电设计5 .质量管理文件范本：为应用者提供符合国家卫生部的验收标准，由多位专家论证并经过长期成熟案例检验的质量管理文件范本（包括质量手册、程序文件、SoP文件）。