辅助生殖科辅助生殖实验室技术操作规范.docx

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1、辅助生殖实验室技术操作规范第一章.精液检查及精子制备第一节、精液常规检查操作方法实验者收到取精杯后应首先核对取精杯上姓名、编号是否与精液送检单符合，同时核对精液送检单上是否漏填重要信息，确认无误后方可接收。操作技术将在原按WHO第四版实验指导手册的基础上过渡，逐步以WHO第五版实验指导手册（WHe）1aboratorymanua1fortheExaminationandProcessingofhumansemen,fifthedition）所规定的方法实施精液常规检查，并以其规定格式出检验报告。同一份精液标本若有多个检查项目，按各项目要求分别做标本处理和检验。（一）初步检验：1 .液化后精液检

2、查前应认真记录：精液检查通知单所提供的全部信息2 .观察记录：精液量、颜色、粘稠度、Ph值及液化时间3 .取液化精液10微升滴于洁净载玻片上，用盖玻片覆盖后静止片刻4 .置生物显微镜下观察精液大致状况并记录镜下所见：圆细胞数（生殖道上皮细胞、生精细胞及白细胞）、红细胞数和凝集团块等,并以个/HP表示。(二)操作方法：1 .取液化后精液10微升，滴于MACRO计数板中央计数池内，加盖；2 .置生物显微镜下观察精子浓度及活力。具体方法如下：分别计数10个小格内前向精子(PR)、非前向精子(NP)及不动精子(IM)的数目，PR+NP+IM之和即为精子密度(X1O6m1),精子活力分别以PR精子、PR

3、+NP精子占总精子数的百分比表示，计算方法为：PR/(PR+NP+IM)100%,(PR+NP)/(PR+NP+IM)100%o附精子活力分级标准：PR：前向运动精子，不考虑速度NP：各种形式的非前向运动精子IM：不动精子(三)检验后处理1 .以清水冲洗MACRO计数板并用酒精棉签擦拭；2 .以酒精纱布擦拭显微镜台面及实验台面；3 .一次性实验物品丢弃于指定地点；4 .剩余标本按规定进行污物处理第二节、精子形态分析操作方法1.取液化后精液20微升，滴于载玻片一端(上方约1/3处)；2 .用另一张载玻片置于滴有精液处与其形成30度角，均匀拉开液滴（详见WHO实验手册），室温干燥；3 .将干燥后的

4、载玻片置于95%酒精中固定15分钟，取出室温干燥后行巴氏染色；4 .100倍油镜下行精子形态学分析，计数100200条精子。结果描述：参阅WHO实验手册正常形态率%异常形态率%（分别记录：头、体、尾及混合畸形率）第三节、精子低渗肿胀试验（HOS）（一）配制低渗肿胀液溶0.735g枸椽酸钠Na3C6H5O72H2O和1.351g果糖于IOOmI蒸储水中。将该溶液分装于-20度冻存。用前解冻并充分混匀。（二）实验方法1 .取Im1肿胀液于一只加盖的Eppendorf管中，37度温热约5分钟。加入0.1m1液化精液，并用吸管轻轻吹打混匀。2 .在37度下至少保持30分钟（注意：不要超过120分钟）,

5、相差显微镜下观察精子细胞。3 .计数200条精子，计算发生肿胀的精子所占百分比。精子尾部形状发生变化的定义为精子肿胀。（三）结果描述肿胀精子所占百分比可以代表存活精子的比例。（四）注意事项1 .某些精液标本在置于HOS溶液前即有尾部卷曲的精子，因此要在放置于HOS溶液前观察射出精液。处理后获得的尾部卷曲精子的百分比减去未处理标本中尾部卷曲精子的百分比，即可以得到HOS试验中出现反应的精子的实际百分比。2 .在临床使用前.，应当用老批号的HOS溶液对新批号的HOS溶液进行校验，二者不应有显著性差异（配对t检验P0.05）o如果差异显著应废弃该批试剂，重新配制。第四节、全自动精子分析系统使用说明（

6、西班牙SCA全自动精液质量分析系统）全自动精子分析系统可自动探测精子运动轨迹，按WHO实验手册内CASA各项参数指标，计数精子活率、活力、密度、直线运动速率等。系统由电脑软件和显微镜两部分组成。操作方法如下：（一） 初步检验：参见精液常规检查操作方法相关部分。（二） 自动分析：1 .开启电脑-CASA分析软件一建立新档案（键入患者信息）2 .取液化精液10微升滴于精子计数板中央计数池内，加盖玻片一置相差显微镜下（IoX）调节视野至图像清晰3 .点击密度活动力分析一进入分析界面一分析一保存结果（如果需要，可以做人工校正）一报告单（预览或打印）一退出分析系统4 .报告部分内容记录于精液分析登记本上

7、，年终存档保留。（三）分析后处理：参见精液常规检查操作方法相关部分。第五节、抗精子抗体（MAR）检测方法（一）原理：本试验以人IgG敏化绵羊红细胞，用人IgG制备羊抗人IgG血清，采用MAR法检测标本中IgG类抗精子抗体。试剂由A液、B液和C液组成。（二）步骤：1 .取液化精液10微升滴于载玻片上，加入A液10微升混匀，放置15秒；2 .加入B液10微升混匀，覆以盖玻片。分别在3分钟和10分钟后于生物显微镜（40X）或相差镜下镜检，观察运动精子表面是否黏附有敏化的红细胞（SRBC）。（三）结果判定：1 .精子表面无AsAb,可见精子在粘附的SRBC间自由泳动，敏化SRBC间的凝集说明试剂可靠。

8、2 .精子表面有AsAb存在，则敏化SRBC粘附于精子上并一同扭动。在强阳性情况下，凝集块极为巨大，精子只在敏化SRBC形成的凝块中扭动。3 .至少计数IOO条活动精子，计算粘附有SRBC的活动精子在总活动精子中所占的百分比。4 .阳性率R=（粘附SRBC的活动精子数/计数总活动精子数）100%R10%,判定为阴性;R10%,阳性；R240%,判定为强阳性。（四）注意事项：1 .试剂需室温平衡后使用；2 .A液使用前应充分混匀；3 .液化不良精液可用C液洗涤后检测；4 .标本中活动精子密度高时，应适当增加活动精子计数的数目。第六节、细针附睾/睾丸穿刺取精术及精子制备常规（一）操作步骤：1 .准

9、备IOmI和5m1及Im1注射器各1支，2%利多卡因5-IOmIo将5m12%利多卡因注射在阴囊部精索内，封闭精索神经。2 .术者用左手固定附睾，选择无血管区以Im1注射器在睾丸表面及阴囊皮肤内注入0.5m12%利多卡因作局部麻醉后，以IOmI注射器直接经皮刺入附睾或睾丸后，边持续负压抽吸边退出，利用负压抽出附睾内精子或睾丸内曲细精管，取下放入含培养液的培养皿中间凹内，立即转交实验室处理。3 .压迫穿刺点至无出血，垫一块纱布于内裤里，患者即可下床行走，嘱其2小时不做剧烈运动。（二）实验室处理：1 .将培养皿内的曲细精管用两支Im1注射针挑动，翻转洗涤12次；2 .将曲细精管叠加切割（撕碎），使

10、精子及其组织细胞游离于培养液中；3 .用于临床诊断可立即镜检（20X）观察有无精子，活动否，通知临床医生；4 .用于临床治疗（ICSI）,混悬液吸入离心管中，静置培养箱孵育30-60分钟，直到用前反复吹打混匀，再静置数分钟，待大块组织沉淀后将上层液体离心（1500转,10分钟）后使用。第七节、伊红试验（一）准备试剂用9g1氯化钠水溶液配制5g1的伊红Y溶液。（二）试验方法1 .将一滴新鲜精液与一滴伊红溶液在载玻片上混匀，并覆以盖玻片。30秒后在400倍光学显微镜下观察。2 .计数200条精子，并区分活精子与死精子。活精子不着色（白色），死精子被染成红色。（三）结果描述计数条活精子数条（%）死精

11、子数条（%）第二章.宫腔内人工授精的实验室处理第一节、取精取精前一般禁欲5-7天，过长或过短的禁欲时间均有碍精子的质量，但对于精液差的病例可适当延长禁欲时间。取精时间安排在IU1前1-2个小时，取精在专用取精室中进行，室内配有双人床或三人沙发，每日紫外线消毒、擦台面。病人在取精过程中须保持取精室周围环境安静，以免造成精神紧张引起取精困难。若发生取精困难可以性交方式取精；有些男性不习惯医院环境可在家取精并在半小时之内将精液送至医院，运送过程中应注意精液保温。取精前患者丈夫先排尿冲洗下尿道，清洗双手，将已写上姓名及病史号的取精杯交患者丈夫并做如下交待：取精杯已消毒，勿污染杯内壁，精液射入取精杯后应

12、立即将杯盖旋紧尽快送实验室处理。实验室收到取精杯后应记录收到时间、核对姓名。逆行射精的取精方法：逆行射精主要表现为患者性交过程中有射精感，但没有精液射出。若膀胱颈在将要射精时未能关闭，射出的精子可能会逆行进入膀胱中，性交后在尿液中发现精子则可确诊。对于逆行射精患者需要特殊处理，取精前口服碳酸氢钠4克5-7天以碱化尿液，有利于保持尿液中精子的活动力。不可服用咖啡及饮料,可以服茶水，服水的目的是使尿液的渗透压降低，若有条件测量尿液的渗透压，在尿液渗透压达到280-320之间时取精最好，取精前测量尿液的PH值，应在6.8-7.4之间。逆行射精的患者需要特殊的容器来收集精液，手淫前排尿，不必完全排空膀

13、胱，如果手淫中有精液射出应收集于容器中，手淫后立即排尿或导尿将尿液收集在另一个容器中。尿液样本必须马上处理，因为即使在服用了重碳酸盐之后尿液仍是酸性的，几乎会立即杀死精子。一旦样本送到实验室，马上测量及记录尿液的体积及PH值。尿液样本必须要充分混匀，因为死精子会下沉到容器的底部。所有的精子，即使是不动的精子，都需要计数。将一滴尿液样本滴在载玻片上进行计数，如果精液数量足够多，还应滴一滴精液样本在Maker板上进行分析。对浓缩后的尿液及可能获得的精液，采用密度梯度离心处理，尿液样本以150Og离心IOmin。然后用新鲜的培养液重新悬浮沉淀。离心时，正常射出的精液(如果有的话)也应进行分析。从尿液

14、中取得的沉淀也应该在载玻片上或者Maker板上分析其密度、活力以及形态。第二节、精液处理1试剂J：1)精子洗涤培养基：用于精液洗涤和培养的试剂很多，但有二点是共同的，第一，均含有人体蛋白，如白蛋白或血清；第二，均含有葡萄糖。这两个成分是精子体外获能所必需的。用于精液洗涤的培养基按其所含的缓冲剂不同分为两大类，一类是以碳酸氢钠做为缓冲剂，需在5%的二氧化碳气体中保持PH值在7.4左右，但在空气中很快变碱；另一类培养基含有低浓度碳酸氢钠及高浓度的HEPES,这类试剂在空气中PH变化很缓慢，可长时间保持PH在7.4左右，但在5%二氧化碳环境中PH值变酸。以上两类培养基均可用于精子洗涤，但有研究表明用

15、含HEPES的培养基处理精子能更好地保护精子的功能，IUI妊娠率更高。目前精子洗涤培养基已商品化，有些出厂时已添加人体白蛋白(HSA),有些需自己添加蛋白或血清。培养基可以是简单的平衡盐溶液如人输卵管液(HTF)、Ear1es液(EBSS)、Tyrode,s液(T6)等，有些精子培养基配方很复杂，如HamsF10o2）梯度离心试剂：目前用于梯度离心试剂很多，本中心使用的ISoiate在出厂时渗透压、PH值及梯度已调好并做过严格的生殖毒性检测，用前只需预温，现开现用。2.仪器及耗材1）仪器：离心机（水平式）、干热培养箱、恒温试管架、电动加样器、超净工作台、冰箱、试管架、显微镜、精子计数板。2）耗材：15m1尖底离心管、14m1圆底离心管、IOmI刻度量管、9英寸无菌巴士德管、人工授精管（TomCat）、Im1B-D注射器、5m1全塑料B-D注射器、酒精灯、硅胶接头、载玻片、盖玻片。3）精液冷冻保存设备及试剂、耗材：液氮、液氮罐、精液冷冻试剂、冷冻管等。3 .处理前准备1）取精前临床工作人员应通知实验室有关人员预温处理精液所需的试剂及试管，打开超净工作台并准备仪器。2）精液取出后应尽快放35-37C恒温培养箱中保温，每5-10分钟摇动几下促使精液液化。3）正常精