黄颡鱼GnRHR基因的克隆和表达及CRISPRCas9构建GnRHR基因敲除突变体.docx

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1、摘要：为研究促性腺激素释放激素受体(gonadotropinre1easinghormonereceptor,GnRHR)对黄颗鱼Pe1teobagrusfu/o/drac。性别分化和性腺发育的调控作用，采用逆转录PCR、氨基酸序列多重比对、系统进化树分析及实时定量PCR方法，对黄颗鱼GMi基因的序列、表达和进化进行了研究。结果表明：扩增到的黄藏鱼的CDNA序列长2894bp,包含239bp的5非翻译区，1155bp的开放阅读框和1500bp的3非翻译区，预测编码384个氨基酸、7次跨膜结构域蛋白；氨基酸序列多重比对显示，黄藏鱼GnRHR与硬骨鱼类GnRHR的同源性较高，其与斑点叉尾蒯Icta

2、1urusPUnCtatus、斑马鱼Daniorerio鲤Cyprinuscarpi。、银鲫CarassiusauratusGnRHR氨基酸序列的一致性分别为96%、87%、83%和82%,与哺乳动物的一致性较低，为42%44%；系统进化分析显示，黄颗鱼GnRHR与鲤、虹蹲等硬骨鱼类的GnRHR聚为GnRHR1IB分支；实时定量PCR显示，量领隹GnRHRmRNA主要在端脑、中脑、下丘脑、垂体和精巢中高表达，但在卵巢和其他组织中几乎不表达；通过CRISPRCas9基因编辑技术构建和筛选出了黄颗鱼GnRHR突变体,成功获得了各种不同的黄领鱼而的FO代突变体。研究表明，GnRHR可能参与调控黄颠鱼

3、雄性发育，黄颖鱼GnRHRFo代突变体的获取为探索GnRHR的功能和机制提供了基础资料。关键词：黄颠鱼；促性腺激素释放激素受体(GnRHR)；基因表达；CRISPR/Cas9基因编辑；突变体脊椎动物的性腺发育与成熟主要受下丘脑-垂体性腺轴(hypotha1amic-pituitary-gonada1axis,HPG)为核心的内分泌系统调控。促性腺激素释放激素(gonadotropinre1easinghormone,GnRH)作为HPG轴重要的信号分子，在生殖活动中发挥了关键的调控作用。在哺乳动物中，Gr1RH由下丘脑神经内分泌细胞合成，以脉冲式释放，经下丘脑-垂体门脉系统到达垂体前叶，与促性

4、腺释放激素受体(gonadotropinre1easinghormonereceptor,GnRHR)结合从而发挥作用。大部分硬骨鱼类缺乏门脉系统，下丘脑合成的GnRH通过轴突末梢作用于垂体，与垂体中GnRHR结合，诱导促卵泡激素(fo11ic1e-stimu1atinghormone,FSH)和促黄体生成激素(IUteiniZinghormone,1H)的合成和释放。FSH和1H通过循环系统作用于性腺，调控类固醇激素的合成、配子发育和成熟。此外，GnRH还可通过旁分泌或自分泌的方式，调整血液中局部促性腺激素的含量及固醇类性激素水平，从而调控动物的性行为。GnRHR隶属G蛋白偶联受体超家族，其

5、由7个跨膜螺旋构成，包括3个胞内环和3个胞外环。通常G蛋白偶联受体的胞内C末端，对于受体的脱敏和内化十分重要。然而，GnRHR有包含和不包含胞内C末端两种蛋白变体。最早被鉴定的小鼠GnRHR蛋白缺乏一个典型的细胞内C末端。在其他哺乳动物及某些低等脊椎动物和软骨鱼类中，也相继发现了缺少胞内C末端的GnRHR蛋白。近年来，在哺乳动物和非哺乳动物中，还发现了具有典型胞内C末端的GnRHR蛋白。因此，依据是否存在细胞内C末端结构域，Roch等将缺乏细胞内C末端的GnRHR归类为GnRHRI,将具有C末端的GnRHR归类为GnRHRGA和GnRHRIIB；Wi11iams等又将GnRHRIIA进一步分为

6、GnRHRnAT、GnRHRIIA-2和GnRHRIIA-3o硬骨鱼中存在GnRH-IGnRH-II和GnRH-III3种GnRH旁系同源基因，其中，GnRHTI存在于目前已经分析的所有硬骨鱼中，GnRH-I存在于大多数的硬骨鱼中，其主要起刺激垂体合成和分泌促性腺激素的作用,而GnRH-H和GnRHTn主要起神经递质的作用。在鱼类生殖内分泌活动中，GnRH与GnRHR的结合是GnRH发挥作用的重要基础。因此，研究GnRHR的分子特征和表达模式对于理解GnRH-GnRHR信号通路的生理学功能具有重要意义。黄颠鱼Pe1teobagrusfu/r/drac。隶属于硬骨鱼纲Osteichthyes也占

7、形目Si1uriformes鳏科Bagridae黄颗鱼属Pe1teobagrus,其肉质鲜美、营养丰富、无肌间刺，是中国重要的淡水养殖品种。黄颗鱼精巢成熟比卵巢晚，雄性生长速率比雌性快，因而雄性个体偏大。在相同养殖条件下，第一年雄性黄颗鱼比同龄雌鱼的生长速度快30%左右，第二年雌雄生长差异甚至能接近3倍。本实验室前期工作构建了黄颠鱼高密度遗传连锁图谱，鉴定出11个与性别相关的数量性状位点(quantitativetrait1ocus,QT1),并从这些QT1附近的参考基因组区域鉴定出6个性别相关基因，其中包括黄颗鱼GnRHR基因,GnRHRN能参与黄颗鱼性别分化和性腺发育。本研究中，克隆了黄领

8、鱼GMi初?基因，分析其序列特征、系统进化关系和组织表达模式，并利用CRISPRCas9基因编辑技术构建和筛选出黄颗鱼GnRHR突变体,以期为深入研究GMi7?突变体在生殖发育过程中的作用提供材料，为进一步了解黄颗鱼生殖调控机制及探索黄颗鱼人工繁殖技术提供科学依据。1材料与方法1.1 材料试验用黄颗鱼取自珠海市斗门长源苗场，选取健康无病的黄颠鱼活体运回实验室。经过麻醉和放血后，取心、肝、脾、肾、端脑、中脑、小脑、下丘脑、垂体、精巢及卵巢等组织，在液氮中速冻后于超低温冰箱(-80)中保存备用。用于人工繁殖的黄颗鱼雌雄亲本同样取自珠海市斗门长源苗场，在繁殖季节,选取发育状况良好的黄颠鱼雌雄亲本活体

9、运回实验室,于28水温、自然光周期和持续充氧条件下暂养3d,之后进行催熟和人工授精。1.2 方法1.2. 1总RNA的提取和CDNA的合成按照50IOOmg组织样品与1m1Trizo1(InVitrogen)的比例,向各个样品管中加入适量TriZ比,用均质破碎仪(托莫斯)匀浆40s,其后按照操作手册提取总RNA。总RNA的质量和浓度通过15g1琼脂糖凝胶电泳分析和紫外分光光度仪(岛津)确定。根据PrimeScriptniRTreagentKitwithgDNAEraser(TaKaRa)操作手册，以1Rg总RNA作为模板反转录成cDNAo1.2.2黄颠鱼而的基因克隆、序列分析及系统进化树构建将

10、黄颠鱼基因组中6面片段在NCB1数据库进行同源检索，发现与已提交的一个黄颗鱼劭做?基因序列(GenBankID：113661459)一致性高达99%以上。因此，设计引物GnRHR-Yi和GnRHRR1,以脑和性腺混合cDNA文库为模板，扩增黄藏鱼而的cDNAoPCR反应产物用10g/1琼脂糖凝胶电泳进行检测，并回收目的产物。将纯化的PCR产物克隆到PMDT8T载体，转化至大肠杆菌DH5感受态细胞中，挑取阳性克隆，送广州天一辉远公司进行测序。将所得序列利用ORFFinder查找开放阅读框，并推导其相应的氨基酸序列。从GenBank中查询出其他物种GnRHR的氨基酸序列，利用B1ast进行氨基酸同

11、源性分析。利用MEGA6软件采用最大相似性法(Maximum-1ike1ihoodmethod),进行1OoO次自展重复，构建基于GnRHR氨基酸序列的系统发生树。1.2.3基因的组织表达采用RT-qPCR法检测的例加在黄颠鱼心、肝、脾、肾、端脑、中脑、小脑、下丘脑、垂体、精巢及卵巢组织中的表达情况。采用2”法计算6必发的相对表达量，以飞。作为内参基因，以GnRHZ2和GnRHR-W1作为特异引物进行RT-qPCR扩增(表1)。表1试验用引物及其序列Tab.1SequencesoftheprimersusedforthePCRana1ysis引物primer序列SeqUenCe(53)GnRI

12、IR-FGnR11RR1caccacacacacctgagcccacCTGCTCGGTCCTTCTCAOTCTC(iCTTTTTTTATTTATAGGRHR-F2TggataacagcagctttgtgaatgGnRHR-R2TTACTGACCGCTGCAAATACAAAC；-ac1in-FTctatgaaggttatgctctgcccc-actin-RAtttccctctcagctgtggtagtgGnRR-E2-FTCcAGGAGTTAAAGCTGACTGTGGGnRHR-E2RGnRHR-gRNA1-FGnRHR-gRN2-FAGACyXCAGTTGTGTAAAGCTGAGCTaatac

13、gactcactataggcaccac-CCCTTCCCCTGTTT-TAGAGCTAGAAATAGCTaatacgactcACTATAgoaggat-GCTGGTGACTGCA(iTTT-TagagctagaaatagcgRNA-RAaaagcaccgactcggtgcc1.2.4 黄颗鱼人工繁殖黄领鱼人工催熟和催产：雌鱼注射促黄体生成素释放激素类似物(1HRH-A2)20口g/kg；1012h后，雌鱼注射1HRH-A215Ug/kg、地欧酮(DOM)IOmg/kg和人绒毛膜促性腺激素(HCG)800Ukg,雄鱼注射剂量为雌鱼的1312,催产水温为2829C。黄颠鱼人工授精：解剖雄鱼取出精巢

14、，用干净的剪刀剪碎，加2m1生理盐水稀释，收集到干净的EP管中4下避光保存；轻轻挤压雌鱼腹部将鱼卵收集到无水的玻璃培养皿中，加入50U1精液，充分混匀,在装有干净饱气水的玻璃皿中铺开受精。5-10min后，用水轻轻清洗去除废液和杂质。1.2.5 黄颠鱼而脑火基因敲除突变体的构建与筛选根据黄颠鱼而谢基因组序列，利用Cas9靶位点预测网站设计2个打靶位点(httpzifit.partners.orgZiFiTCSquare9Nuc1ease,aspx)。对试验所需的黄颠鱼雌雄亲本剪尾鳍，利用TiSSUeDNAKit(On1ega)提取基因组DNA,采用引物6MP-E2-F和GnRHRE2-RPCR

15、扩增靶位点附近序列，PCR产物送去测序，确认靶点序列不存在单核昔酸多态性。设计并合成特异的gRNA弓I物(表1),以pUC19-gRNA-scaffo1d质粒为模板,进行PCR扩增，产物采用GeIExtractionKit(Omega)回收纯化。随后采用TranSCriPtAidT7HighYie1dTranscriptionKi用Thenno)体外转录gRNAo另外，pCS2-Cas9质粒经过限制性内切酶XbaI线性化后回收并纯化,随后采用mMESSAGEmMACHINET7Kit(InVitrOgen)体外转录Cas9mRNAo按照300、30、30ngR1的最终浓度混合Cas9mRNA、

16、foW-gRNA1和GnRHR於旧1。将1n1上述混合物注射到黄颗鱼的1细胞期胚胎中，于28下培养，受精72h后收集40尾小鱼苗，提取基因组DNA。以上述基因组DNA为模板，用引物GnRHRB2T和GnRHRE2R进行PCR扩增，产物回收纯化后克隆到pMD78T载体，转化至大肠杆菌DH5感受态细胞中，挑选40个阳性克隆送去测序。2结果与分析2.1黄颗鱼而也?基因的克隆及序列分析将黄颗鱼基因组中片段在NCB1数据库进行同源检索，发现与已提交的一个黄颗鱼GMeH基因序列(GenBankID：113661459)一致性高达99%以上。从图1可见，在脑和性腺混合cDNA文库中扩增得到的GnRHR六段符合预期大小，经克隆和测序证实与NBCI上提供的序列一致。本试验中扩增到的黄颗