香螺线粒体COXⅠ和CYTB基因遗传多样性研究.docx

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1、摘要：为探明香螺Neptuneacumingii遗传多样性水平及其种质资源背景，采用分子生物学技术对中国黄、渤海海域6个不同地理群体香螺期I和基因的遗传多样性进行比较分析。结果表明：W1基因序列长度为1536bp,多态性位点141个，共定义COXX单倍型11个，大连市大连湾群体(D1)的单倍型COX-10变异位点数最多(115个)，群体内遗传多样性分析显示，大连湾群体的平均核甘酸差异数(冷和遗传多样性指数(0最高，分别为31.133和0.02121,群体间比较结果显示,烟台市八角港群体(YT)与蓬莱市长岛群体(P1)间的片值最低094),大连湾群体与大连市旅顺盐场群体(1S)间的4值最高(24

2、.971)；W7基因序列全长为1140bp,多态性位点34个，共定义单倍型14种,群体内遗传多样性分析显示，大连市獐子岛群体(ZZ)和大连市旅顺盐场群体的人和值最高，分别为13.444和0.01236,群体间比较结果显示，烟台市八角港群体与蓬莱市长岛群体间/值最低(1395),大连湾群体与旅顺盐场群体间的人值最高(11.497)；聚类分析结果显示，6个不同群体香螺的线粒体口Zr1和CYTB基因有显著性差异，分子方差分析(AMOVA)显示，群体内变异远大于群体间差异。研究表明，不同海域香螺未出现明显的群体间差异，且群体内变异远大于群体间差异，不同海域间香螺未达到亚种分化。关键词：香螺；戊Zn基因

3、；基因；遗传多样性香螺Neptuneacumingii隶属于软体动物门Mo11usca腹足纲Gastropoda新腹足目Neogastropoda蛾螺科Buccinida,其壳近菱形，壳质坚硬，颜色为浅褐色，螺层约为7层。香螺为冷水性大型种类，其肉质鲜美肥嫩，营养丰富，富含有人体必需的微量元素。香螺肉可加工成干制品，也可鲜食，深受人们喜爱，市场价格近120元kg,经济价值较高，是非常具有增养殖潜力的螺类。香螺分布范围较小，在中国主要分布于黄、渤海海域，日本、朝鲜海域也有分布。目前，关于香螺的研究较少，主要集中于香螺壳质、营养元素、繁殖生物学等方面。近年来，有学者初步开展了香螺遗传多样性的研究，

4、隋娜基于微卫星标记的方法研究了辽宁及山东5个地理群体香螺的遗传多样性，发现地理位置与遗传多样性存在一定的联系。日本学者Azuma等利用分离的多态微卫星标记技术分析了日本北海道海域香螺种群的遗传多样性，发现基因可用于鉴定香螺种群和亲缘关系。然而微卫星技术在PCR扩增时可能会出现无效基因的情况，进而影响群体的鉴定结果。本研究中，通过分析中国黄、渤海海域6个不同地理群体香螺Sn和GZ基因的遗传多样性水平，试图明确中国香螺遗传多样性水平和种质遗传背景，旨在为香螺健康养殖及其资源保护和种质管理提供科学参考。1材料与方法1.1 材料试验用香螺于2017年6-10月采自大连市大连湾(D1)、大连市獐子岛县(

5、ZZ)、大连市旅顺盐场(1S)、烟台市八角港(YT)、威海市(WH)、蓬莱市长岛县(P1)6个海域，样本各10尾，用保温箱运回至大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室。解剖，剪取每尾个体的腹足肌组织，用过滤海水洗净，称重，并于-80C冰箱中保存待用。1.2 方法1.2 .1DNA提取、COXX和基因扩增及测序剪取香螺腹足肌组织约20mg,剪碎并装入离心管。采用TIANGEN海洋动物基因组提取试剂盒提取DNA,用10g/1琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用紫外分光光度计测量DNA的质量和浓度，于冰箱(-20C)中保存备用。香螺线粒体COXX基因扩增引物为F：5Atgcgttgattatt

6、ttckacaaatca3；R：5,Tcttgaaatcctarttgtcctcatag3。线粒体67基因扩增引物为F：5,Cttcccttcgtcctttcaat3；R：5,Gacaaatattccccaggaataac3。PCR反应体系(50R1)包括：IOXBuffer51,dNTP(10mmo11)51,上、下游引物各21(10mo11),模板DNA(50g1)51,ddO31U1o反应条件为：94下预变性5min；94下变性30s,50C(3基因)或55(CJTS基因)下退火复性30s,72C下延伸120s,共进行30个循环；最后在72下再延伸10min,在4下保存。用10g/1琼脂

7、糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。1.3 .2序列分析使用BiOEit软件对测序结果进行比对。采用B1AST检索确定目的基因。采用DNASP5.0(DNASequencePO1ymorPhiSm)软件确认单倍型数，计算6个不同海域群体内核甘酸多样性指数(P)、核甘酸差异系数(给o采用MEGA5.0软件计算COXX和基因的碱基组成、变异位点数并构建单倍型分子系统进化树,Bootstrap重复1000次检验置信度。采用TCS121软件制作单倍型网络支系图，以分析6个不同群体的亲缘关系。采用分子方差分析法(AMOVA)分析香螺不同群体间的遗传分化，并计算

8、遗传分化系数()。2结果与分析2.1 香螺COX1和基因序列的碱基组成及变异分析香螺线粒体COXX和仃力基因长度分别为1536bp和1140bpo变异位点中，两基因均未发现插入/缺失位点。Cf1r1基因检测到141个多态位点，11种单倍型，门力基因检测到34个多态位点，14种单倍型；线粒体COXX基因的T、C、A、G平均碱基含量分别为38.7%、16.2乐27.2%.18.0%,线粒体Ci7基因的T、C、A、G平均碱基含量分别为40.4%、17.0%28.0%、14.6%(表1)。通过对6个不同群体间Q2TI和GTO碱基组成对比发现，两基因的碱基组成较为接近，且A+T碱基含量均大于G+Co表1

9、香螺QZn和小看基因序列的碱基组成Tab.1BasecompositionofCOXIandCYTBgenesofneptunewhe1kNeptuneacumingii群体popu1ation基因grc碱基含量nmT8-061ICYTB-O122CnW-O81ICJTB-09I3610crra-o1ICYTH-U1ICYTB-1222Crra-13I!cm?-41I2.3香螺各群体内COXI和基因的遗传多样性分析6个香螺群体内COXX和Cy历基因的遗传参数如表4所示，COXX及Cy基因的平均核甘酸差异数（值变化范围分别为0.00031.133和1.22213.444,Oan基因/值变化范围较大，且D1群体最高，为31.133,远大于其他群体；核甘酸多样性指数分析显示，Cftn基因中，D1群体的值最高，为0.02121,P1群体的值最低，为0,而GTS基因中，1S群体的值最高，为0.01236,P1群体的值最低,为0.00114o表46个不同海域香螺COXX和基因的群体遗传多样性参数Tab.4Popu1ationgeneticdiversityparametersofCOXIanddifferentseaCYTBgen