酶免疫分析.docx

《酶免疫分析.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶免疫分析.docx（3页珍藏版）》请在第一文库网上搜索。

1、酶免疫分析一、原理：酶免疫分析(enzymeimmunoassay,EIA)的原理与RIA和IRMA相同，不同的是用酶替代放射性核素标记抗原或抗体，经竞争性或非竞争性免疫结合反应，产生的免疫复合物，其中的酶催化特定底物，生成有色产物，可根据有色产物的吸光度不同来对受检样品作定性或定量分析。常用的酶标记物有：辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)用于EIA的主要是HRP的C型同工酶。HRP首先与乩。2结合形成活泼的“氧化剂”，再催化底物氧化生成显色产物。HRP的常用底物有：邻苯二胺(OPD),5-氨基水杨酸(5-ASA)、四甲基联苯胺及其硫酸盐(TMB、TMBS),

2、邻联甲苯胺(OT)等。碱性磷酸酶(a1ka1inephosphatase,AP)：AP系水解酶，将不同的磷酸酯水解使之成为有色产物。常用底物为对硝基酚磷酸酯(p-NPP)、酚歆单磷酸酯(Pheno1phthe1einmonophosphate)o有以下各类EIA：(一)按免疫反应后，是否分离结合抗原(B)和游离抗原(F)可分成：1 .均相EIA又称酶检测免疫分析技术(enzymemonitoredimmunoassaytechnique,EMIA)o酶与半抗原结合为酶标半抗原，与被测半抗原竞争地与抗体结合，标记抗原与抗体结合后，酶的活性即被抑制，因此不需加入分离剂，直接测定游离酶标半抗原的酶活

3、性即可推算被测半抗原的量。EM1A主要用于小分子抗原或半抗原的定量如激素、药物或毒品等的分析。2 .异相EIA酶标抗原或抗体与标本中的待检抗体或抗原结合，分离除去未结合酶标抗原或抗体后，加入酶底物显色即可作定性或定量分析。常用固相分离法，又称为酶联免疫吸附分析(enzyme1inkedimmunosorbentassay,E1ISA),与均相EIA相比，该法应用范围较广，可标记各种抗原和抗体。(二)根据所用固相物质不同又可分为：1板式E11SA：全部反应和比色都在塑料微孔板中进行。目前国际通用8X12的96孔板。3 .管式E1ISA：用小管作为反应容器和比色管，反应体积大，比色光径长，可在一定

4、程度上提高检测灵敏度。4 .小珠：一般直径为6mm,吸附面积明显增大。（三）按抗原抗体结合方式可分成：1 .竞争性结合酶免疫法标记抗原与待测抗原竞争地与抗体相结合。2 ,非竞争性结合酶免疫法抗原抗体之间的反应不存在竞争性。1）直接E1ISA酶标记抗体与待测抗原非竞争性结合，再与固相载体形成复合物，称双抗体夹心法，常用于测定较大分子抗原。2）间接E11SA酶标记的第二抗体作为一种通用试剂，可与任何第一抗体结合。现以应用最为广泛的E1ISA为例加以说明。二、试剂组成1酶标抗体（抗原）：要求酶稳定不失活，4。C可保存数月。2 .固相抗体（抗原）：聚苯乙烯微孔条，透明度高，吸附性能好，材质均匀，孔间差

5、异小。包被抗原纯度高，包被抗体效价高，亲和力强，4七、密封、避光、干燥的环境中保存，一般可保存6个月。3 .底物：底物应稳定，易于保存。OPD为白色粉末，易于氧化并对光敏感，应密封保存于棕色瓶内，4。C干燥环境下存放，临用前配制。而TMB配制后密封保存在棕色瓶内，4。C可存放半年。4 .结合物和标本的稀释液：稀释液中常加入高浓度的无干扰作用的蛋白质（如10g1BSA或50g1脱脂奶粉），一般还含有0.05%非离子表面活性剂如Tween20,可抑制蛋白质在塑料表面的非特异性吸附。5 .洗涤液：常用含0.05%Tween20的PBSo6 .酶反应终止液：常用2mo11硫酸。7 .校正试剂：参见时间

6、分辨荧光免疫分析。8 .质控血清：参见放射免疫部分。三、检测条件和方法（一）仪器设备专用微量加样器、加样头、平板震荡器、水浴箱或孵箱、洗板机、酶标仪。全自动酶联免疫分析系统，可精确控制反应条件，结果更为可靠。（二）样品采集、处理和储存见放射免疫部分。（三）检测方法以CanAg公司NSE检测试剂盒为例，其免疫反应原理为生物素-链霉亲和素参与的双抗体夹心法（生物素-链霉亲和素系统原理参见电化学发光部分），具体检测程序如下：1将251样品或标准品按顺序加入链霉亲和素包被的微孔条中。2 .每孔加入IOOHI单抗工作液（含HRP标记抗NSE单抗和生物素标记抗NSE单抗），形成生物素-抗体-抗原-抗体-H

7、RP免疫复合物，并通过生物素-链霉亲和素的特异性结合固定于微孔内壁。3 .室温孵育Iho4 .洗涤微孔条并在滤纸上拍打除去残留洗涤液，重复6次，以去除游离的或抗体。5.加底物应用液（包含TMB和比。2）。震荡反应30min06.加终止液，混匀后在酶标仪上读取OD值，按要求作数据处理，得出结果。（四）资料保存及报告要求参见时间分辨荧光免疫分析。（五）质量控制见放射免疫部分。四、注意事项1HRP对金属污染物很敏感（甚至不能使用金属的加样器），因此对试剂和试验用水的要求较高，应用新鲜的蒸储水或去离子水。但通过聚苯乙烯树脂得到的无离子水常影响HRP活力，如果不使用TWeerI20,作固相载体用的聚苯乙

8、烯板也可影响HRP活力。另外，HRP对细菌及抑菌剂如NaN特别敏感，因此用NaN3防腐的标本不可用于HRP标记的一步法E1ISA；试验用水中的氧、次氯酸、芳香族的氯碳化合物都会影响HRP的活力。此外应注意压。2不仅是HRP的底物，也是HRP的抑制剂，过量的压。2对固相HRP的抑制作用比游离HRP更明显，因此HRP的浓度应维持在0.01%0.03%之间。同时，乩。2易挥发，放置过久引起浓度降低，可使OD值降低。2.0PD可能有致癌作用，故目前倾向用TMB代替OPD。3 .AP有两种来源牛的肠黏膜和大肠杆菌，二者的最佳酶活度的PH值不同，前者为PH10,后者为PH8。无机磷酸盐是AP的强抑制剂，因此试验中应避免使用PBS液；金属络合剂如EDTA也是AP的强抑制剂，应注意避免。4 .孵育最好在水浴中进行，E1ISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡，各板不可重叠，板上应加盖防止蒸发。如在孵育箱中反应，应将板置于湿盒中。