新型冠状病毒2019nCoV核酸混采样本检测标准操作规程.docx
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1、1.检验目的体外定性检新型冠状病毒(2019-nCoV)ORFlab和N基因,用于新型冠状病毒感染的体检筛文件名称新型冠状病毒2019-nCoV核酸混采样本 检测标准操作规程文件编号PLA63750-S0P-007版本/修订号D/0编制人审核人批准人生效日期查。2.检测原理与方法对新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF Iab及编码核衣壳蛋白N基因的特异性保守序列为靶区域, 进行了双靶标基因的设计,配以PCR反应液,在荧光定量PCR仪上,应用实时荧光定量RT-PCR 检测技术,通过荧光信号的变化实现样本RNA的检测。PCR检测体系包含有内源性的内标引物和探针,通过检测内标是否正常来监测样本采
2、集、提 取过程,避免假阴性结果。3.职责保证分子生物组实验室对于新型冠状病毒(2019-nCoV)筛查检测结果的可靠性。4 .性能特征4. 1准确性检测企业阳性参考品,结果均为阳性。4. 2特异性本试剂盒与冠状病毒(NL63, HKUl,229E,0C43) SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型流 感病毒、乙型流感病毒YainagaIa型、Victoria型、甲型HINl流感病毒、甲型H3N2流感病 毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、呼吸道合胞病毒A、B型、鼻病毒A、B、C 型、腺病毒1、2、3、4、5、7、55型、副流感病毒1、2、3型、肠病毒A、B型、肠病毒C型 (EV-
3、C95).肠病毒D型(EV-D70)、偏肺病毒、人间质肺病毒、新生隐球菌、化脓性性链球 菌、鲍曼不动杆菌、肺泡子虫、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞 菌、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、 肺炎衣原体、EB病毒、人巨细胞病毒、烟曲霉、白色念球菌、光滑念珠菌、结核分枝杆菌、 非结核分枝杆菌、诺如病毒、轮状病毒、水痘-带状疱疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人 类基因组DNA等阳性样本无交叉反应。检测企业阴性参考品均为阴性。4. 3精密度批内精密度Ct值的变异系数(CV,%)W5%.4.4最低检测限本试剂盒最低检测限为200 copies
4、/mLo5.标本类型及要求5.1 样本类型:咽拭子、肺泡灌洗液。5.2 样本采集:5.2. 1咽拭子:用1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁,将拭子头 浸入含L 5ml病毒保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液)的管中,尾部 弃去,旋紧管盖。5. 2. 2肺泡灌洗液:局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌 段的支管,将其顶端契入支气管分支开口,经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水,每次30 50 InL总量10025OmL不应超过300ml。5 . 3样本灭活:将样本保存管置于金属浴56。C以上保持30分钟。5.4样本保存和运送:待测样本可
5、立即用于处理,能在24小时内检测的标本可置于4保存; 24小时内无法检测的标本则应置于-70或以下保存(如无-70保存条件,待测样本可于 -20保存10天,核酸样本-205保存15天)。应避免反复冻融。样本运送采用冰壶加冰或泡 沫箱加冰密封进行运输。6 .标本包装和运输6. 1标本采集后在生物安全二级实验室生物安全柜内分装。6. 2所有标本应放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管里,拧紧。容器外注 明样本编号、种类、姓名及采样日期。6. 3将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封,每袋装一份标本。样本包装要求要符合危 险品航空安全运输技术细则相应的标准。6. 4涉及外部标本运输的,
6、应根据标本类型,按照A类感染性物质进行三层包装。7 .试剂和仪器7. 1试剂:新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)7. Ll试剂来源:湖南圣湘生物科技有限公司7. 1.2试剂组份:序号试剂名称规格与装量主要成分12019-nCoV-PCR-反应液624L/管引物(4. 62%)、探针(LI5%)、dNTPs(3. 85%)、MgC12 (0.77%)Rnasin(0. 48%)、PCR buffer(89. 13%)22019-nCoV-PCR-酶混合液96 L/管RT 酶(62. 5%)、Taq 酶(37. 5%)32019 - nCoV-PCR-阳性对照500 UL
7、/管含目标基因(ORFlab、N基因)、内标基因 片段(RnaSe P)的体外转录RNA42019 FCoV-PCR-阴性对照500 UL/管生理盐水7. 1.3开启所有试剂需注明口期及签名。每个试剂盒都应贴有下列标签:物质名称、批号、特 殊储藏说明、开盖人、开盖日期、开盖后有效期。开启时应检查试剂是否变色,是否有肉眼 可见的细菌生长迹象、浊度、沉淀反应等,这些表示已经变质或超过保质期。7.1. 4试剂应避光密闭,试剂组分保存于-205。7.1.5生产口期,失效口期请见外包装盒。不使用时,这些试剂在包装标识的效期内可稳定存 放。一旦使用,扩增试剂盒反复冻融应不超过3次。7. 2仪器:适用于上海
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