发光免疫分析.docx
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1、发光免疫分析发光免疫测定采用化学发光物质作为标记物,根据发光原理的不同,可分为三类:化学发光免疫分析(chemi1uminescenceimmunoassay,C1IA);酶增强发光免疫分析(enhancedchemiIuminescenceenzyineimmunoassay,EC1EA);电化学发光免疫分析(e1SPECTrochemiIuniinescenceinimunoassay,EC1IA)o一、化学发光免疫分析(chemi1uminescenceimmunoassay,C1IA)(一)原理:发光物质标记抗体或抗原,标记的发光物质通过氧化反应获得能量,处于激发态,当返回基态时以光子
2、的形式释放能量,其发光强度与被测物质浓度相关。用于标记物的化学发光物质有:氨基苯二酰明类即异鲁米诺及其衍生物,如氨基己基乙基异鲁米诺(AHEI)、氨基丁基乙基异鲁米诺(ABEI)、半琥珀酰胺、硫代异氤酸等;叫嗟酯类;苯酚类化合物;咪嘎类;芳基草酸脂类。目前应用较为广泛的是口Y唉酯类。口Y嘘酯(acridiniumester)是一种三环有机化合物,在碱性介质中易氧化,其氧化过程经历多价键的断裂,经过一个二氧酮的中间体,产生一个电激发的10-甲基t1Y唉酮,当它回复到基态时在43Onm处释放出光子。叫嗟酯的特点是:分子量小,因而对被标记物的空间位阻小;发光反应快速而强烈,背景噪音低;直接发光,无需
3、酶催化,反应时间短,误差小;受PH和温度影响小,检测精确度高;性质稳定,试剂保存期长。现以Bayer公司的ACS-180检测系统为例加以说明。(二)试剂盒组成1校正试剂:参见时间分辨荧光免疫分析。2 .叫咤酯标记的抗原或抗体由于在碱性条件下水溶液中存在有内源性过氧化物,可使发光化合物缓慢地失去活性,故标记物应保存于pH7.0以下。3 .抗体包被的顺磁性固相微粒是以三氧化二铁为核心的聚苯乙烯颗粒,直径12m,特点是表面积大,可吸附大量抗体;均匀地悬浮在反应体系中,类似均相反应,可有效提高反应效率。4 .试剂1:0.5%H202,0.INHNOao5 .试剂2:0.25NNa0Ho(三)检测步狭全
4、部试验过程均在全自动化学发光免疫检测系统上按预设程序自动完成,整个检测过程用时20min左右。步躲如下:1待测标本或校正试剂+口丫咤酯标记的抗原或抗体+顺磁性固相抗体;2 .37温育一定时间;3 .磁场作用于磁性微粒使之沉淀;4 .吸去上清液,除去未与固相抗体结合的游离抗原和(或)抗体;5 .洗涤磁性微粒2次;6 .加入试剂1;7 .加入试剂2,使叫喘酯氧化处于激发态后回复基态,并发出光子,整个过程在Is内完成;8 .ACS:180的光度检测系统读取发光强度并经数据处理计算待测物质浓度。(四)资料保存及报告要求参见时间分辨荧光免疫分析。(五)质量控制见放射免疫部分(六)注意事项1 .应严格按照
5、仪器说明书要求做好维护保养工作,保持管路清洁畅通。2 .性固相微粒保存于缓冲液中,易沉淀,应在加样过程中持续旋转混匀,避免加样不均。混匀时注意不可产生泡沫。3 .为使本底降到理想水平,除采用纯化学试剂外,应使用Q21000kQ的去离子水。二、酶增强发光免疫分析(enhancedchemiIuminescenceenzymeinimunoassay,EC1EA)(一)原理EC1EA是将化学发光物质作为酶的发光底物,由酶触发化学发光物质激发过程,产生光子。通过酶标抗原或抗体间的竞争性或非竞争性免疫结合反应,形成酶标复合物,再加化学发光底物,经酶促反应发光。其发光持续时间可长达30TIi1I以上,同
6、时发光强度也大为提高,改善了信噪比,提高了灵敏度。目前常用的EC1EA系统有两种:1 .辣根过氧化物酶-压。2-鲁米诺-增强剂系统在此系统中辣根过氧化物酶(HRP)可使山。2产生新生作用于鲁米诺,形成激发态中间体,并分解发光,经增强剂(如对位碘酚、对位苯基酚)作用,可使发光时间延续30InirI以上,信号强度增加IOOO倍以上。该系统已开发成熟的商业性试剂如AnIer1ite系统。2 .碱性磷酸酶-环1,2-二氧乙烷衍生物系统常用的发光底物为金刚烷基1,2-二氧乙烷磷酸盐以及3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷酸氧基)-苯基-1,2-环二氧乙烷,简称AMPPD。AMPPD经酶解去除
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