免疫放射分析法.docx

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1、免疫放射分析法一、原理免疫放射分析法(Immunoradiometrieassay,IRMA)是用过量的放射核素标记抗体(*Ab)和限量的抗原或半抗原(Ag)结合，形成Ag*Ab,其放射性和所加Ag的量呈正相关。如以不同量的Ag标准品求出与Ag*Ab放射性的量效关系，即可从待测样品在相同条件下测得的Ag*Ab放射性求出待测样品的量。Ag+*AbW,Ag*Ab抗原过量抗体复合物1 .从原理的角度讲，IRMA的主要特点包括以下几方面。2 .属于非竞争性抗原抗体结合反应。3 .抗原抗体复合物的量与所加非标记抗原的量呈正相关。4 .因为不存在竞争结合反应，低剂量区没有不确定因素，因此灵敏度较高。5 .

2、分离步歌的主要目的是把*Ab和Ag*Ab分开。由于*Ab和Ag*Ab都含球蛋白，分子量也比较接近，很多在RIA中常用的分离方法都不能用，需要用特异抗体作分离剂。这在很大程度上造成了IRMA在方法学上的特殊性，即几乎全部是夹心法，也就是一个IRMA系统中需要两个抗体，都是针对同一个抗原的，但是抗原决定簇不同，一个抗体标记后作为探测抗体，一个抗体用作分离剂。正是这一特点，使IRMA的测定对象主要限于有两个以上抗原决定簇的肽类或蛋白质。6 .由于Ag越小Ag*Ab放射性越低，所以在IRMA中NSB的高低对低剂量Ag测量的准确性影响大，如何降低NSB对灵敏度很重要。二、试剂盒基本试剂试剂盒的基本要求和

3、R1A试剂盒相同，由国家批准的生产单位提供，使用者应按说明书的要求合理使用。如果临床工作需要，使用者可以对试剂稀释度、操作步骤等进行适当改动，但对改变了的方案应作精密度、准确度、灵敏度等考核，并作详细记录。一般试剂盒都包括三种主要试剂：标记抗体、非标记标准抗原(标准品)、分离试剂或材料，很多试剂盒还提供缓冲液及质量控制用的样品。7 .标记抗体标记抗体必须亲和力高、特异性高。通常都由生产厂家精选后用侬I标记,可以是多克隆（PO1yCIOna1）,也可以是单克隆（monoc1ona1）抗体。一般说首先要保证特异性，所以多数试剂盒选用单克隆抗体。对于抗体的亲和力，通常由生产厂家测定，借用RIA的SC

4、atChard作图法，对尚未连接您I的抗体进行鉴定，然后向用户提供数据。为了保证标记抗体的特性与未标记前一致，制备标记物的条件要温和，每一抗体分子最好仅含一个I为原子。由于125I的衰变等不稳定因素，厂家应当提供试剂盒的有效期。8 .标准品或校准试剂标准品是定量的依据，要求纯度尽量高，配制时浓度应准确，并注意保存。9 .分离试剂和材料即固相抗体。通常也由生产厂家提供。所用抗体必须和标记抗体针对不同抗原决定簇。也可以是多克隆（p。IyC1Or1a1）或单克隆（monoc1ona1）抗体。该抗体预先牢固地吸附在某种固体支持物上，待测抗原一个抗原决定簇和标记抗体结合，另一个抗原决定簇和固相支持物上的

5、非标记抗体结合，便能和游离抗体分开。很多材料可供选用，如塑料（聚乙烯、聚苯乙烯、尼龙等）、纤维素、凝胶颗粒（葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）、多孔玻璃微球、磁性颗粒等。磁性颗粒法是将固相颗粒（如纤维素）与含铁化合物（如氧化铁）连接，再与抗体连接，此种颗粒在磁场吸引下不需离心即可与游离标记抗原分开。10 .质量控制样品及缓冲液等要求和RIA相同。11 .三、测定方法12.IRMA的测定方法一般也包括加样、孵育、分离结合和游离部分、测放射性、数据处理等五个步骤。很多方面和R1A相似，不再一一重复。由于不是竞争结合，当然不存在经典加样法和顺序加样法之分。但是从加样顺序及所用标记试剂的不同，又有几种不同

6、情况。1 .双抗体夹心法实际应用时，有抗原先和固相抗体结合再加标记抗体的，有同时加的，也有先让标记抗体与抗原结合，再加固相抗体的。由于抗原抗体的结合反应是在标记抗体过量的情况下进行，有不少IRMA的反应允许在室温下进行,可以缩短孵育时间，每一具体IRMA系统的加样顺序、孵育时间、孵育温度、分离条件（离心所需g数及时间、或磁性颗粒用磁场吸引等）通常都应按照试剂盒的说明书进行。最后形成下述复合物。固相抗体一待测抗原一叼标记抗体2 .标记第三抗体法这种方法是将125I标记在第三个抗体上，此时原来带标记的用作分析试剂的抗体不带标记，而标记的第三抗体则是针对该分析抗体的，如果分析抗体是鼠的抗体，则第三抗

7、体用兔（或羊或豚鼠）抗鼠的抗体。所以这种抗体具有多用性，凡是分析抗体来自同一种动物的都可以用。第三抗体往往前两个抗体已经和抗原充分反应后再加。最后形成下述复合物。固相抗体一待测抗原一非标记分析抗体一1iI标记抗体3 .双标记抗体法未了进一步提高IRMA的灵敏度，有人建立了双标记抗体法，该法要求待测抗原有三个以上抗原决定簇，形成至少三个不同结合位点的抗体，其中一个作分离剂，另两个以1为标记，用作分析抗体。最后形成下述复合物。/125I标记抗体固相抗体一待测抗之125I标记抗体4 .生物素亲合素系统（biotinavidinsystem,BAS）的引入对提高灵敏度及缩短分析时间有较明显的效果。生物

8、素可以用来标记抗体，而且每一抗体分子可以连接几十个分子的生物素。生物素又能和125I标记的亲合素牢固结合（KA达10M10*1/InO1）,因此该系统本身的放大效应很明显。在IRMA中，用生物素标记的抗体代替您I标记的分析抗体，充分反应后再加侬1标记的亲合素，形成下述复合物使分析灵敏度明显提高。固相抗体一待测抗原一生物素标记抗体一啊标记亲合素四、数据处理和质控IRMA的数据处理除数学模型外都和RIA相仿，质控也和RIA相同，此处不再重复，仅就数学模型作一简要叙述。早期曾认为四参数1ogistic是IRMA较好的数学模型。但是四参数1ogistic模型只适合对称性曲线，而实际上IRMA的曲线是不

9、对称的，因此近年来已不主张应用，1ogit-1og法当然也是不合适的。目前认为可以应用的曲线拟合法有以下三种：1 .平滑样条函数把各点直观地连起来加以平滑。待测样品以内插法求得含量。目前有的试剂盒生产厂家仍推荐这种方法。但是本法缺乏理论依据，遇有突出值时影响大。此外，有些试剂盒生产厂家迄今仍推荐直线化的方法，认为在IRMA的低剂量区域是一条直线，如果仅使用厂家指定的区域，可以用直线回归法。应当指出，用这种方法近似是可以的，但是不论是理论上或精密的实践中都可以证实，即使是低剂量区也不是直线，对于要求高的实验不宜采用。2 .五参数1OgiStiC模型在四参数1OgiStiC模型上加一不对称因子，由计算机通过最小二乘回归求得五个参数。不对称因子即下式中的Co本法虽适用于IRMA的多数场合，但是不对称因子是一经验参数，并非来自质量作用定律。a-d.rd1+(Xfc)bY3 .三参数质量作用定律模型函数式如下：R2b(c+q)+X+Rc(b1)+DqC=O(2)式中各参数的含义与RIA的四参数质量模型相同。该模型已用稳健回归法编成应用软件，经多年来多个IRMA系统的实际应用，结果是满意的。