体外分析技术放射免疫分析.docx
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1、体外分析技术放射免疫分析体外分析技术是指在试管内进行反应从而测定某生物活性物质的超微量分析技术。该类技术的特点是高灵敏度和高特异性,广泛用于临床和科学研究的很多领域。应用最多的是:放射免疫分析、免疫放射分析、受体的放射配基结合分析及非放射性免疫分析。一、原理放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)的基本原理是,限量标记抗原*Ag和可变量的非标记待测抗原Ag与定量的特异抗体Ab发生竞争结合反应,通过测定复合物的放射性来计算出待测非标记抗原的量。这一过程可用下式表示:*g+g+Abgb*+gb上述式中,Ab的分子数少于*Ag,因此即使系统中没有Ag,仅有*Ag,当反应达到平衡时,
2、绝大部分(因为是可逆反应,不会是100%)Ab将形成*AgAb复合物。如果系统中加入Ag,则Ag与*Ag竞争结合Ab,形成AgAb,*AgAb将减少。Ag越多则*AgAb越少。实践和理论推导都证明,*AgAb和Ag呈二次方程的函数关系,如以Ag为横坐标,*AgAb(B)或*AgAb占加入总*Ag的(B%)为纵坐标,是一条斜率逐步由大变小的下降曲线。如以游离的*Ag(F)或游离*Ag占加入总*Ag的(F%)为纵坐标,则是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。也可以*AgAb*Ag的比值(R)为纵坐标,也是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。分析中,首先以不同量的已知标准品Ag和定量*Ag及限量Ab进行竞争
3、结合反应,得到以B或B%、F或F%、或R为纵坐标的剂量效应曲线(也称标准曲线),然后以未知样品测得的B或B%、F或F%、或R从曲线上查出相应的剂量。二、试剂盒基本试剂试剂盒由国家批准的生产单位提供,提供R1A的主要试剂、操作方法、保存条件及保存期限。使用者应按说明书的要求合理使用。如果临床工作需要,使用者可以对试剂稀释度、操作步.骤等进行适当修改,但应当对改变了的方案进行精密度、准确度、灵敏度等考核,并作详细记录。一般试剂盒都包括三种主要试剂:抗体、标记抗原、非标记标准抗原(标准品),很多试剂盒还提供分离试剂或材料、缓冲液及质量控制用的样品。1抗体一个好的抗体应具备三个条件,即高亲和力、高特异
4、性、高滴度。高亲和力的抗体是高质量RIA的前提。只有这样的抗体才能获得高灵敏度和高精密度的标准曲线。高特异性也非常重要,样品中往往含待测物质结构相近的类似物,如果抗体特异性不高,则类似物也能与抗体结合,成为干扰物质,影响分析结果目前,RIA用的抗体大多由专门的研究单位或生产R1A试剂盒的厂家提供。可以是多克隆(PoIyC1ona1),也可以是单克隆(monoc1ona1)抗体。一般说前者容易获得高亲和力,后者的特异性更好,而且后者可使抗体的来源得到长期保证。对RIA的使用者来说,更重要的是能了解抗体的主要性能。亲和力的测定最常用的方法是SCatehard作图,得到以AgAb的浓度为横坐标,以B
5、/F为纵坐标的直线,直线的斜率即KA。2 .标记抗原对标记抗原的主要要求是:比活度和放化纯度必须足够高,以保证分析的灵敏度;半衰期不能太短,以便完成运输、保存和整个分析过程;不改变原有抗原的特性(特异性、亲和力、免疫活性等)。基于以上要求,目前大分子抗原(蛋白质)主要用125I标记。小分子半抗原可选侬1或用。用标记蛋白质,应使每一蛋白分子不超过一个原子的侬IJ25I过多可导致蛋白质免疫活性或其它特性的变化。标记方法应较温和,强氧化或强还原反应易使蛋白质性质发生变化。方标记半抗原可以每一分子达14个用原子甚至更多,但也需保证不改变抗原的特性。3 .标准品或校准试剂标准品是定量的依据,要求纯度尽量
6、高,配制时浓度应准确,并注意保存。4 .质量控制样品质控样品(QCPooI)是专为质控而制备的与待测样品性质相同(例如最常用者为人血清样品)而含量为已知的样品。它们在偏差和漂移的监测中起着决定性作用。对质控样品的基本要求是:在分析的全过程中与待测样品有相同的行为特点;制备和保存必须有良好的稳定性和重现性;应有足够的量供长期使用,新旧两批质控样品交接时必须平行测定至少两次,以保证它们的连贯性;应包括与标准曲线使用范围相呼应的高、中、低三种剂量。5 .分离试剂和材料放射免疫分析中,绝大多数情况是保留和测定复合物的放射性,除去游离抗原。少数情况是除去复合物,测定游离抗原的放射性。游离抗体无放射性,不
7、干扰测量,是否除净并不重要。分离方法可分两大类,分述如下。1.抗原抗体在液相环境中起反应,终止反应时用一定方法收集复合物测量放射性。常用者有双抗体沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法或PEG与双抗体法联合使用、葡萄球菌A蛋白(SPA)沉淀法等,使复合物沉淀测定B部分。另一种吸附分离,用右旋糖首包被活性碳(称Dee)或其它吸附剂,吸附小分子抗原,离心后复合物留在上清液中供测量。2 .另一类方法是预先将抗体吸附在某种固体支持物上,抗原抗体反应就在支持物上进行,反应结束后只需将周围未结合的游离抗原洗去,测定固体支持物上的放射性。很多材料可供选用,如塑料(聚乙烯、聚苯乙烯、尼龙等)、纤维素、凝胶颗粒(葡聚
8、糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等)、多孔玻璃微球。3 .固相分离法是RIA近年来发展较快的领域。例如磁性颗粒法将固相颗粒(如纤维素)与含铁化合物(如氧化铁)连接,再与抗体连接,此种颗粒在磁场吸引下不需离心即可与游离标记抗原分开。三、测定方法RIA的操作一般都包括加样、孵育、分离结合和游离部分、测放射性、数据处理等五个步骤。1 .加样在冰浴(有的系统可在室温)中进行,一系列试管中加入相同剂量的抗体、相同剂量的标记抗原、不同剂量的标准抗原(作标准曲线)或一定量样品。有两种方式:一种是经典加样法,即抗体、抗原及标准抗原或样品全部加完后开始蜉育,一种是顺序加样法,即先加抗体和非标记抗原或样品,蜉育一定时间后再
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