Mx3000P荧光定量PCR仪.docx

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1、Mx3000P荧光定量PCR仪标准操作规程1 .目的规范MX3000P荧光定量PCR仪的操作过程，保证结果的准确、可靠。2 .应用范围PCR室扩增区MX300OP荧光定量PCR仪。3 .仪器原理该仪器具有精确的温度控制系统，宽大的光学检测范围和操作简便而功能强大的软件，通过曲线呈现、数据分析直观的体现检测结果。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。同时独特的内具芯片具有断电保护功能。4 .技术参数4. 1激发光源：石英卤鸨灯，激发波长350-75Onm4.2检测器：超过灵敏度光电倍增管（PMT）,检测波长350-70Onm4. 3热循环系统：半导体PeIt

2、iCr,96孔加热模块4.4 样品管规格：标准96孔微孔板、8联管、200UIPCR单管4.5 反应体积：1050UI4.6 可供选择的滤光片：A1EXAF1uor350,FAM/SYBRGreen1/EvaGeen,TET,HEX/JOX/VIC,Cy3,TAMRA,ROX/TexasRed,Cy54. 7可应用技术方法：Taqman,Mo1ecu1arBeacons,SYBR1SCOrPiOnS,Amp1ifIuor等4.8 检测通道：四通道4.9 线性范围：10个数量级4.10检测灵敏度：单拷贝4.11分辨率：有效区分5000个拷贝与IOOOO个拷贝样品，置信度为99.7%4.12温度均

3、一性：0.25C4.13温度精确性：0.25C4.14升降温速度：平均升降温速度三2.5CS,最大升降温速度三3CS4.15温度范围：室温一994.16反应时间：标准的40个循环2步法定量PCR反应在90分钟内完成，利用FASTQPCR试剂在60分钟内完成。4. 17尺寸：46金（深）*33w（宽）*43金（高）4 .18重量：20公斤5 .操作步骤5. 1检查仪器5.1.1 检查仪器数据线和电源线，确保电源线和数据线正常连接。5.1.2 检查并确保反应孔内无已扩增产物。5.2仪器的启动和参数设置如果5.2.1打开计算机电源，将Mx3000P主机后面电源开关打开，在大约1分钟的时间内，仪器将会

4、自检并且能听到滤镜轮转动的声音。5.2.2打开电脑上的MXPRO控制软件，确定软件界面右下面的联机标志呈现绿色不是绿色而是红色，软件会提示InstrumenttoPCcommunicationshavefai1ed.,这时只需要继续稍等片刻，待仪器自检完成，会自动连接计算机。5.2.3在软件的弹出框中选择您要进行的实验类型，选择第一项“QuantitivePCR（MUItiP1CStandards）”进行绝对定量分析。5.2.4确定卤鸽灯已经打开。（绿色）则说明卤鸽灯已经打开；1（黄色）则说明卤鸽灯正在预热；91（红色）则说明卤鸨灯没有被打开，这时需要用鼠标点击这个标志将光源打开。在卤鹤灯已经

5、被打开的情况下，软件界面右下方会显示！皿bu=8（绿色）。5.2.5最好在仪器与光源预热20分钟后开始实验。5.2.6反应板设置：在（PEteSetUP理,对所选孔进行设定，在We11type中设定Standard（标准品）、NTC（阴性对照）、NPC（阳性对照）、unkown（样品）等，并选择正确的荧光通道（FAM,HEX,ROX,Cy5）,参比荧光（Referencedye）选NOne。对于标准品，在WeI1tyPe中设定为“Standard”后，再设定其模板浓度。方法为：直接点击标准品的各个孔位，在Standardquantity:FAM4e+0007-一栏,手工输入浓度。若要对不同的样

6、品进行编号,则双击所选孔，在name框中输入样品号，点击$府WWHINameS就能显示样品编号。或者点击版面右上方的Import，,导入以前使用的96孔板设定。各项温度、时间、循环数等。在选定大步骤之后添加步骤可选定该大步骤后，点击Addsegment二,或点击鼠标右键，在弹出的对话框中，选择AddSegment,则可在该大步骤之后添加一个大步骤；若是在选定大步骤里面的小步骤后边添加一小步骤，选中该小步骤，点击鼠标右键，在弹出的对话框中选择“AddP1ateauwithRampwo5.2.8要删除某个大步骤，直接选定大步骤，点击界面右边的“De1ete，或者点击鼠标右键选DeIete,即可删除

7、该步骤。如果要删除一个大步骤里的小步骤，可先选定此步骤时间和温度中间的横线，将其变红，如图图，点击界面右边的“四变一”，或者点击鼠标右键选De1ete,即可删除该步骤。点击ImPOrI,导入以前设定的PCR程序。5.2.9虱I(END)代表在这一步结束时采集荧光信号；Q(A11)代表在这一步的全过程都采集荧光信号，一般用作熔解曲线分析。可直接用鼠标将此图标拖到要采集信号的地方。若要去除虱1可将其拖出循环设定区域。5.2.10MI结束之后,点击软件界面右上方的一1会弹出对话框提示：仪器灯源正在预热，需要“马上运行”或者是“灯预热完成后再运行”？点击“灯预热完成后再运行“，可以保护灯源。5.2.1

8、1软件界面右下方会出现运行状态显示框RUnStatUS,点击Start开始实验。在运行过程中可以通过点击AddCyCIeS来增加扩增的循环数。还可以选择勾选Turn1ampoffatendofrun，在PCR运行结束之后软件将自动关闭卤鸨灯。5.2.12在PCR运行的过程中可以点击RawDataP1ots,观察样品的实时扩增原始结果。5.2.13PCR运行结束后，点击金演冶,再点击ReSU1ts,软件将自动进行结果分析，也可点击EA手动进行结果分析。可以手动调节阈值线(拖动)进行分析。点击ShOWStandaMCUNe可显示标准曲线，看斜率、截距、线性相关是否在可控范围内。左下角的Assays

9、shownROXIHEXIFAM可选择相应的荧光观察扩增曲线。右边的AreatoanazeG殛d匠W*?.?!0型tesamp1eva1uesStandardcurveInitia1temp1atequanti1Dudco1orscatterp1otTextreportrconso,ida1ed,epo,u可根据自己的需要选择显示的界面。Amp1ificationp1ots是扩增曲线，6日瓯痴迷：碰诞Ct值列表，阴西良苑应踵标准曲线，f好颐回两豆施邈样本起始浓度,“Te泣report结果exce1表格输出，6晚温演商；&词合并面板，包括设置、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个面板。5.2.14

10、分析曲线时，如果曲线不够光滑，还能用OPtionS中的SmOOthing对曲线进行调节，一般AmP1ifieatiOnaVerage是3,可按需要将其调至较大数值，p1ificationaveragn比如5、7、9,调整后曲线将更光滑，不过Ct值会稍微靠后一点，使数据失真，通常情况下，不建议这么做。OptionsOpticsConfiguration.Ana1ysisIermSettings5.2.15如果需要对每条曲线进行单独的基线设置，点击1Hrenci中的Base1ineCOrreCtiOn,点击AdaPtiVebase1ine,在下面对应的各孔，单独进行基线起始和终止位置的调节。5.2

11、.16关于MX30OOP调用前一次实验标准曲线的补充说明。点击桌面Mx3000P的软件图标，弹出话框：选择MUItiPICEXPerimentAna1ySiS（多项实验结果分析）选项，点击“0K”，出现如下对话框，选择“Usecommonthresho1d进行分析进算，然后点击*吧吧山,导入需要一起分析的上机文件，点击“Finish”即可。5.2.17这里选择时要注意：1.两个或者多个实验结果要有相同的实验程序；2.每次程序中的循环数应该一致。在分析栏可以选择不同实验的不同反应孔进行同步分析。5.2.18分析质控品结果：阴性质控品：增长的曲线不呈S型曲线或NOCt；阳性质控品：增长曲线呈S型曲

12、线，且阳性质控品定量参考值在允许范围；以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。5.2.19结合扩增曲线分析并记录待测样品管中相应基因检测的DNA或RNA定量结果。5.2.20记录实验数据5.2.21取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。5.2.22关闭扩增仪电源和计算机电源。5.3常规维护及注意事项5.3.1确保PCR反应管置于银色的加热模块上，而非黑色的热盖上。5.3.2所有需检测的PCR反应管上面均不可用笔做任何记号，否则将影响仪器的检测结果。5.3.3每天实验结束，关闭电源后，用湿毛巾擦拭仪器表面，除去灰尘等污物。5.3.4每次扩增后，用移动紫外灯对扩增仪进行照射。5 .3.5保持热盖和扩增孔的清洁，特别注意不能将带有荧光染料的试剂溅洒在热盖上或者扩增孔里。如果不小心将荧光试剂溅洒在热盖上或者扩增孔上，请用蘸有95%酒精的干净棉球擦洗,直到不影响试验结果。6 .相关表单6. 1Mx3000P核酸扩增仪维护和保养记录表6.2仪器适用记录表