ICH区域内药典附录的评价及建议细菌内毒素检查法.docx

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1、Q4BAnnex14Bacteria1EndotoxinsTestGenera1Chapter关于ICH区域内药典附录的评价及建议-细菌内毒素检查法Step52012/10/18关于ICH区域内药典附录的评价及建议细菌内毒素检查法Q4B附录142010年6月10日，进入ICH进程第二阶段，公开征求意见1. 目录前言Q4B成果-2.1分析方法2. 2判定标准2. 附录的实施时间对实施附录的考虑4. 1总体考虑4.2 美国食品药品监督管理局（FDA）的考虑4.3 欧盟（EU）的考虑4.4 日本厚生劳动省（MH1W）的考虑4.5 5加拿大卫生部的考虑用于Q4B评价的参考文献关于ICH区域内药典附录的

2、评价及建议一细菌内毒素检查法Q4B附录141 .前言本附录是Q4B对药典附录细菌内毒素检查法协调后的成果。本文件由药典协调组（PDG）提出。2 .Q4B成果2.1 分析方法2.1.1 家工作组（EIVG）审核，1CH指导委员会建议，当符合下列条件时，欧洲药典附录2.6.14（细菌内毒素检查法）、日本药典附录4.01（细菌内毒素检查法）以及美国药典附录（细菌内毒素检查法）中各自规定的分析方法，在ICH区域中具有同等效力：2.1.2 细菌内毒素检查法中可以使用三种测定技术中的任意一种。当对测定结果有怀疑或争议时，以凝胶限度检查法结果为准。2.1.3 细菌内毒素工作标准品应采用WHo（世界卫生组织）

3、细菌内毒素国际标准品进行标定。2 .2判定标准评价后的文本中未包括判定标准。除非在各论项下有规定外，应在申报资料中给出细菌内毒素限度。3 .附录的实施时间当本附录在某地区实施时(进入ICH第五阶段的管理进程)，即可在该地区使用，各地区的实施时间可以不同.4 .对实施附录的考虑4.1 总体考虑当申请者或生产企业将其现有方法变更为经Q4B审核并已实施的药典方法时(参见本附录第2.1节)，应按照当地有关备案型变更的有关规定，处理相关的变更说明、变更和/或事先的审批程序。4.2 美国食品药品监督管理局(FDA)的考虑基于上述建议，并结合本附录的相关规定，可认为本附录第2.1节的中相关药典文本具有同等效

4、力。但是，不论该方法源自何处，FDA都可能会要求企业证明其所选方法的合理性并适用于某一特定的物料或产品的质量控制。4.3欧盟(EU)的考虑基于上述互认声明，当符合本附录规定的条件时，在上市许可申请、再注册申请或变更申请中，欧盟药品管理当局允许申请者采用附录第2.1节所述其它药典的相应方法，认为同样满足欧洲药典附录2.6.14的要求。4.4日本厚生劳动省(MH1W)的考虑当符合本附录规定的条件时，本附录第2.1节中各药典的文件具有同等效力。当本附录在日本实施时，MHIM将在通告中规定具体的实施要求。4.5加拿大卫生部的考虑在加拿大，当符合本附录规定的条件时，本附录第2.1节所述的相关药典具有同等

5、效力。5.用于Q4B评价的参考文献5.1 PDG5B阶段签发的文件(版本1-修订D：JapanesePharinacopoeia1Forum,Vo1ume18,number4(December2009).5.2 与本附录细菌内毒素检查法相关的药典参考文献有：5. 2.1EuropeanPharmacopoeia(Ph.Eur.):Supp1ement6.6(officia1January1,2010),Bacteria1Endotoxins(reference01/2010:20614);6. 2.2JapanesePharmacopoeia(JP):Genera1Test4.O1Bacter

6、ia1EndotoxinsTestasitwi11appearintheJPSixteenthEdition(March31,2011).ThedraftEng1ishversionoftheJPtextprovidedbyMH1wisappended(seeAppendixA);7. 2.3UnitedStatesPharmacopeia(USP):TextforBacteria1EndotoxinsTest,USP33Reissue(pub1ishedApri12010andofficia1October1,2010).附件A日本厚生劳动省提供的JPXVI英文版草案4.生物测定法/生物化学

7、测定法/微生物测定法4.01细菌内毒素检查法本文件为与欧洲药典和美国药典协调后的版本。细菌内毒素检查法系利用常(1imUIUSpo1yphcmus或Tachyp1eustridentatus)血液提取物中制备得到的变形细胞溶解液，检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素。可采用两种技术进行细菌内毒素检查：凝胶法，系通过赏试剂与内毒素产生的凝集反应进行测定；光度法，系通过内毒素与微试剂反应产生光学变化进行测定。光度法中包括浊度法和显色法(显色基质法)：浊度法，系利用邕试剂与内毒素产生凝集反应发生浊度变化进行测定：显色基质法，系利用合成肽-呈色团聚合物的释放呈色团产生颜色变化进行测定。可采用上述方

8、法中的任意一种进行检测。当对测定结果有怀疑或争议时，除另有规定外,以凝胶法测定结果为准。本法操作过程中应防止微生物的污染。1 .器具应按照经过验证的程序将所有玻璃器皿和其他热稳定材料置于干热烤箱中去除热原。通常使用的最低温度和最短时间为250加热30分钟。如果使用塑料器具，例如多孔板和微量加样器的吸头，只有证明其不含有可检出的内毒素并对试验无干扰方可使用。2 .溶液制备2.1 内毒素标准储备溶液的制备取日本药典内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水(简称BET用水)溶解制备内毒素标准储备溶液。用内毒素单位(EU)表示细菌内毒素的量，IEU与1个内毒素国际单位(IU)相当。2.2 内毒素标准溶液的制

9、备将内毒素标准储备溶液充分混匀后，用BET用水稀释制备一系列内毒素标准溶液。制备的标准溶液应尽快使用，以免由于吸附造成活性损失。2 .3供试品溶液的制备除另有规定外，采用BET用水溶解或稀释药物制备供试品溶液。必要时调节被测溶液的PH值，使赏试剂与供试品溶液的混合溶液的PH值落在赏试剂指定的使用PH范围内。木法适用于制备PH值在6.08.0范围内的供试品溶液。用于调节PH值的试液或溶液，可采用BET用水配制，并将溶液在未检出内毒素的容器中储存。必须对试液或溶液进行验证，证明不含可检出的内毒素并且无干扰因素。3 .确定最大有效稀释倍数最大有效稀释倍数（MVD）是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最

10、大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限度的检测。用以下公式来确定MVD：MVD=内毒素限值X供试品溶液的浓度/内毒素限值：注射剂的内毒素限值是根据剂量确定的，即为K/M,其中K为每公斤体重最小内毒素剂量（EUkg）,M为每公斤体重最大供试品剂量。当注射剂按照一定间隔给药或持续滴注时,M为1小时内注射的最大剂量。供试品溶液的浓度：当内毒素限值以质量（EUAng）表示时，浓度单位为mg/m1；当内毒素限值以当量（EUmEq）表示时，浓度单位为mEq/m1；当内毒素限值以生物单位（EU/Unit）表示时，浓度单位为UnitS/m1；当内毒素限值以体积（EUm1）表示时，浓度单位为m1/m1；

11、:凝胶法中宣试剂的标示灵敏度（EUm1）或浊度法或显色基质法中使用的标准回归曲线上最低的内毒素浓度（EUm1）o4 .凝胶法凝胶法系通过邕试剂与存在的内毒素产生凝集反应的原理来检测或定量内毒素的方法。为保证测定方法的精密度和有效性，应按预试验（4.1）项下方法进行赏试剂灵敏度确认试验（4.1.1）及干扰试验（4.1.2）4.1 预试验4.1.1 邕试剂灵敏度确认试验邕试剂的标示灵敏度是指在翟:试剂使用的指定条件下导致宜试剂发生凝集所需内毒素的最低浓度。当使用新批号的赏试剂或试验条件发生任何可能影响检验结果的改变时，应进行本试验，以确认赏试剂的标示灵敏度。采用BET用水稀释内毒素标准储备溶液制备

12、浓度分别为2入，,0.5和0.25人的四个标准溶液。在每个试管中加入一定体积的翟:试剂与相同体积的内毒素标准溶液（通常为0.1m1）,混匀。当试验中使用含有冻干邕试剂的小瓶和安甑时，可直接在小瓶和安额中加入上述溶液。通常将含有反应混合物的试管（或小瓶、安瓶等容器）在371C条件下放置602分钟，避免振动。为测试保温后形成的凝胶的完整性，缓缓倒转每支试管或容器180oo若倒转后凝胶不从管壁脱落，记录试验结果为阳性。若未形成坚实的凝胶，或形成易碎的凝胶在翻转中脱落者记为阴性。制备四个浓度的标准溶液组，每组浓度平行4份试验。当0.25人的标准溶液管均显示为阴性结果时，试验有效。若试验无效，在确认试验

13、条件后重复试验。反应终点浓度为系列递减浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。按下式计算4个重复系列的几何平均终点浓度值：几何平均终点浓度=Ig1（ef）e=稀释系列的终点浓度的对数值和f=重复支数若几何平均终点浓度不低于05人并不高于2人，表明标示灵敏度有效，该翟:试剂可用于内毒素检查。4.1.2 干扰试验本试验用于确认供试品溶液中是否存在放大或抑制反应的因素。按表4.O1T制备溶液A,B,C和D：溶液A,B平行制备4管；溶液C和D平行制备2管。按4.11项下规定的孵育温度、孵育时间及凝胶形成的确认程序进行试验。当发生任何可能影响试验结果的试验条件的变更时，必须重新进行本试验。表4.01-1溶液内毒

14、素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数内毒素浓度平行管数A*10/供试品溶液-4B*22/供试品溶液供试品溶液1248210.50.254C*32/BET用水BET用水1248210.50.252D*40/BETff1zK-一-2* 1阴性对照，只含供试品溶液。* 2加入了标准内毒素的供试品溶液（用于测定干扰因素）。* 3用于确认标示量试剂灵敏度的标准内毒素溶液* 4阴性对照，只含BET用水。当溶液A和D的所有平行管均为阴性，且溶液C的结果与标示的宣试剂灵敏度一致时，本试验方为有效。若溶液B的几何平均终点浓度不低于0.5,并不高于2时，供试品溶液在该浓度下无干扰作用，且符合干扰试验的规定。

15、其他情况均认为供试品溶液干扰内毒素的检测。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。使用更灵敏的宜试剂时，可允许对供试品溶液进行更大倍数的稀释。此外，可以通过过滤、中和、透析或加热处理等手段，排除供试品溶液或稀释后的供试品溶液对测定的干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，应使用预先添加了标准内毒素并经过处理的供试品溶液进行干扰试验。4.2 限度检查法本法系与内毒素浓度高于标示宣试剂灵敏度所产生的凝胶相比，用于检测样品中含有的内毒素是否高于标准项下规定的内毒素限度。4.2.1 测定法按表4.01-2制备溶液A,B,C和D。制备4种溶液，每种溶液平行制备2管。制备溶液A和B时，采用的供试品溶液应符合4.1.2中的规定。按4.11项下规定的孵育温度、孵育时间及凝胶形成的确认程序进行试验。表4.01-2溶液内毒素浓度/被加入内毒素的溶液平行管数A*10/供试品溶液2B