HER2驱动胃癌的个性化治疗策略.docx

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1、发表：2023年323HHER2驱动胃癌的个性化治疗策略 斯特凡诺Uahetto, 克里斯蒂娜米利来, U1 西尔维娅乔尔达诺515访问1引用指标详情摘要背景曲妥珠单抗是唯一批准用于”日?2扩增转移性胃癌（GC）患者的靶向疗法。遗憾的是，在临床实践中，只有一小部分人从基于曲妥珠单抗的前期策略中获得了长期利益。为了推进精准肿瘤学，我们研究了不同HER2靶向策略在HER2“超”扩增（28个拷贝）肿瘤中的治疗效果。方法我们通过临时临床前试验的设计，在选定的H日?2超扩增胃患者来源异种移植物（PDX）亚组中，对单克隆抗体、酪织酸激而抑制剂和抗体-药物偶联物的HER2靶向进行了前瞻性评估。结果尽管HER

2、2扩增水平很高，但曲妥珠单抗仅在8个PDX模型中的2个中引起部分反应。曲妥珠单抗加帕妥珠单抗或拉帕替尼的双重HER2阻断在8个模型中的5个（62.5%）中产生了完全和持久的反应，其中包括一个伴随HE/?2突变的肿瘤。在具有KR45扩增的耐药PDX中，新型抗体药物偶联物曲妥珠单抗deruxtecan（但不是曲妥珠单抗emtansine）克服了QSS介导的耐药性。我们还确定了一种HGF介导的非细胞自主机制对抗HER2药物的继发性耐药，对MET共祀向有反应。结论这些临床前随机试验清楚地表明，在HER2驱动的胃肿瘤中，需要加强HER2治疗阻断以获得最佳疗效，从而在大多数情况下产生完全和持久的反应。我们

3、的结果表明，选定的HER2“超扩增GC患者亚群可以从这一策略中受益匪浅。尽管临床试验的结果为阴性，但对于明显对HER2成瘾的癌症患者，应重新考虑双重阻断。简介曲妥珠单抗是唯一被批准用于转移性胃癌（mGQ患者的靶向治疗，H日?2是一种分子驱动因子，属于受体酪氨酸激酶（RTK）的表皮生长因子受体（EGFR）家族。HER2通路的组成性激活，通常是由于基因扩增或突变，已在几种实体瘤中观察到，在这些实体瘤中它驱动肿瘤生长、转移和血管生成IJoHER2在大约IO-15%的GC中扩增2,3），通常与染色体不稳定性（QN）分子亚型有关，尽管在HER2中发现肿瘤内和病灶间异质性升高-放大的GC（4,5oToGA

4、试验的事后分析表明，在化疗中加入单克隆抗体（MoAb）曲妥珠单抗可显着改善局部晚期或转移性胃癌或胃食管交界处癌患者的总生存期（OS）,但仅在更高水平的HER2表达（IHC3+或IHC2+与基因扩增）。遗憾的是，只有一小部分HM2患者-扩增的mGC明显受益于曲妥珠单抗，令人怀疑该方案在临床实践中对整体HER2阳性人群的实际成本效益。事实上，基于曲妥珠单抗的治疗长期疗效的限制可能是由于高比例的原发性和获得性耐药机制涉及QK/K/SS联合扩增、PI3KAkt轴失调、H日?2丢失、包括d16HER2在内的HER2蛋白质组的异质性剪接变体和潜在的，非细胞自主机制a7,89】。除了曲妥珠单抗之外，目前还有

5、几种HER2靶向药物被批准用于HER2阳性乳腺癌患者，包括MoAb帕妥珠单抗联合曲妥珠单抗、小分子EGFR/HER2酪获酸激酶抑制剂拉帕替尼和抗体药物偶联物（ADC）曲妥珠单抗emtansine（T-DM1）和曲妥珠单抗derutecam（DS-8201a）然而，在MGC这些试剂进行的第3期试验均为阴性1Q，11，12）o虽然在乳腺癌和胃癌中，曲妥珠单抗作为单药治疗也有效，但在其他癌症（如结直肠癌中，只有曲妥珠单抗加其他抗HER2药物（包括帕妥珠单抗或拉帕替尼）的双重HER2阻断显示出显着的活性13,14,151.值得注意的是，”日?2扩增水平可能会极大地影响曲妥珠单抗的长期疗效，建议将HM2

6、基因拷贝数与染色体17若丝粒之比为4.7作为识别具有特殊反应的患者的最佳临界值K。基于上述假设，可以想象，新型HER2靶向策略或双重抗HER2阻断剂的潜在作用应该在分子筛选的HER2超扩增/HER2成瘾癌症患者中重新评估。目前，验证目标和确定有效治疗的最佳临床前模型以患者衍生异种移植（PDX）为代表，它结合了临床前评估的多功能性和基于人群的研究的信息意义（12,ISJo利用专有的、分子注释的GCPDX集落*,我们在选定的日?2超扩增异种患者亚组中，通过设计旨在改善HER2阳性GC的个性化治疗的临时临床前试验。材料和方法患者肿瘤样本（来自胃和胃食管交界处癌）和匹配的正常样本是从15家意大利医院接

7、受手术的患者中获得的（参见增刊方法）。所有患者均提供书面知情同意书；收集样本并在所有机构审查委员会的批准下进行研究。该研究是根据赫尔辛基宣言、国际协调和良好临床实践指南和GDPR（通用数据保护条例）的原则进行的。临床和病理数据被输入并保存在我们的前瞻性数据库中。所有样本在运送到Candio1o癌症研究所（Candio1o,都灵，意大利）之前都已匿名。原代细胞培养如（2Q中所述，GC原代细胞源自PDXo体外衍生材料与原始肿瘤的遗传同一性已通过短串联重复分析（CeI1ID.Promega）得到验证。对于细胞活力测定，在指定药物存在的情况下，将细胞一式四份接种在96孔培养板（3-5X10，细胞/孔）

8、中。6天后，使用Ce11TiterGIo1uminescentCe11Viabi1ityAssay（Promega）测量细胞活力。蛋白质印迹分析用指定的药物处理细胞24小时，在活力测定中以对应于IC50的浓度使用(如图例所示)。使用1aemmIi缓冲液制备全蛋白提取物，并使用BCA蛋白检测试剂盒(PierCe,Rockford,I1USA)进行定量。EBV评估使用EBVQ-PCRAIertKIT(E11TechGroupSpA.Puteaux,France)进行EBVDNA的检测和定量。实时扩增分析在ABI7300实时PCR系统仪器(美国应用生物系统公司)上进行。PDX的分类如21中所述：EB

9、V高(EBV负荷高，IOoO,等效EBV基因组/反应(gEq),EBV中间(75-100OgEq)或EBV低/阴性(2代，直到产生一组小鼠。确定的和随机化的肿瘤(平均体积250mmO用以下方案(单一药剂或组合)治疗指定天数：载体(盐水)口服：曲妥珠单抗30mgkg,每周ip：帕妥珠单抗20mgkg,每周ip：拉帕替尼100mgkg,每日一次，口服：TDM110mgkg,每周静脉注射，DS-8201a10mgkg,每周静脉注射：克嗤替尼25mgkg,每日一次，口服。通过卡尺测量每周评估一次肿瘤大小，并使用公式43n(D2)(d2)z计算质量的近似体积，其中D是主要肿瘤轴，d是次耍肿瘤轴。对治疔的

10、反应已使用类似RECIST1.1的标准评估小鼠的反应，即疾病进展(PD)：从基线增加35%；部分缓解(PR)：从基线降低50%；疾病稳定(SD)：与基线的中间变化22o使用GraphPADPRISM软件8.0,使用双向方差分析和Bonferroni多重比较校正对药理实验进行统计测试。统计显着性：ns=不显着：*P0.05；*p0.01：*p0.001；*p0.0001c基因组测序收集从PDX模型中提取的DNA以及来自每位患者的正常种系DNA样本，用于下一代测序。使用标准方法，生成I11umina测序文库并进行杂交捕获，其中包含243个基因的集中靶向诱饵集，这些基因是根据先前肖食管癌研究中的改变

11、而选择的19,23oGTR0455己在川UminaNOVaSeq平台上使用Agi1entSureSeIectXT人全外显子V6文库(MacrogeneInc,首尔，韩国)对全外显子组进行测序。原位杂交和免疫组织化学如前所述24,使用HER2(17q12)和CEPD探针(VysiszInc,DownersGrove,I1,USA)对4m厚切片进行双色FISH。在Candio1o癌症研究所，使用HerCePTeStTMPerDakc)AUtOStainer(安捷伦)以集中方式对4m厚切片进行HER2IHCo使用来自R&DSystems的P-MET（Tyr12341235）抗体AF2480对P-ME

12、T进行免疫组织化学。根据RNAscope2.5RED检测方案（#322452和#322360）,将用于小鼠HGF的RNAscope探针（Mm-Hgf-O1#435381,AdvancedCe11Diagnostics）在4mFFPE毂玻片上杂交。连续载玻片用小鼠特异性对照探针（mmPPIB：肽基-脯氨酰搬机反式，染色异构曲B,未显示）。之后，通过免疫组织化学实验，按照标准方案将相同的载玻片与抗人细胞角蛋白抗体（CIOneAE1/AE3#M3515-DAKOG1ostrupDenmark）杂交。为了量化基质（泛细胞角蛋白阴性）区域中的阳性信号量，至少以20倍放大率捕获了2张数字图像/幻灯片。使用

13、ImageJ软件（NIH）量化RNAscope阳性区域（红色区域）。简而言之，包含在肿瘤区域中的细胞核（泛细胞角蛋白染色）已被排除在分析之外；已计算出与基质区室相对应的面积；背景已被减去。使用HPAS作为向量进行颜色反卷积，分成三幅图像，每个通道一个（第一个通道包含核，第二通道RNAscope阳性点）。最后，通过为同一通道中的所有图像设置相同的尺寸和圆度，对两个通道进行粒子分析。每个分析图像的阳性率，作为基质HGF量的代表，如下：RNAscope阳性面积/（细胞核面积+RNAscope阳性面积）*100。分析是在盲法下进行的。结果胃癌PDX中HER2扩增的患病率和对曲妥珠单抗的反应从显示犷增的

14、肿瘤中获得的临床前和临床数据表明，临床相关阈值至少为8个基因拷贝迈因此，我们通过实时qPCR570原发性GC进行分析，并确定了具有8个日?2基因拷贝的原发性肿瘤（补充表1）0其中8名患者接受了含有曲妥珠单抗的治疗方案：其中6名对治疔有反应（SD或PR）0从570个样本中，我们能够在151个案例中生成PDX。其中，8个PDX携带之8个基因拷贝（补充表1）FISH分析证实了基因扩增，IHC分析显示所有模型均为HER23+（补充图D,PDX的组织病理学特征概括了起源肿瘤的组织病理学特征（补充图2A）。此外，在可以对原发肿瘤进行分子分析的情况下，我们观察到原发肿瘤与相应PDX之间相对于突变谱、前Ioo

15、o个最可变CpG位点的甲基化模式和具有良好的一致性。甲基化模式（补充图2B、C、D）o这些PDX模型在体内传代，直到产生5只荷瘤动物/治疗组，以评估纯HER2抑制的效果，没有化疗的混杂效应。当异种移植物达到250mm，的平均体积时，用曲妥珠单抗治疗小鼠并根据REQST样标准评估肿瘤反应（参见方法和图例）。如图1所示，8个模型中只有4个显示对曲妥珠单抗的临床反应，包括两个稳定的疾病（SD,GTRO277和GTRO402）和两个部分反应（PR,GTRO108和GTRo233）。在携带高HERzCNG的PDX中对曲妥珠单抗治疗的反应。意大利面图说明了曲妥珠单抗治疗（30mgkg）对具有HER2CNGn8拷贝的PDX的影响。对于每个PDX模型，单个线代表肿瘤负荷的平均百分比变化，从治疗开始（第O天）至U4周连续连续评估（每个模型N=5只小鼠）。已根据经使用RECIST1.1样标准评估了肿瘤反应：疾病进展（PD）：从基线增加35%（粉红色背景）；部分反应（PR）：从基线降低5O%（绿色背景）；疾病稳定（SD）：与基线的中间变化（黄色背景）全尺寸图片曲妥珠单抗加拉帕