2015年版《中国药典》通则0541 电泳法通则.docx
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1、0541电泳法电泳是指溶解或悬浮于电解液中的带电荷的蛋白质、胶体、大分子或其他粒子,在电流作用下向其自身所带电荷相反的电极方向迁移。电泳法是指利用溶液中带有不同量电荷的阳离子或阴离子,在外加电场中使供试品组分以不同的迁移速度向对应的电极移动,实现分离并通过适宜的检测方法记录或计算,达到测定目的的分析方法。电泳法一般可分为两大类:一类为自由溶液电泳或移动界面电泳,另一类为区带电泳。移动界面电泳是指不含支持物的电泳,溶质在自由溶液中泳动,故也称自由溶液电泳,适用于高分子的检测。区带电泳是指含有支持介质的电泳,带电荷的供试品(如蛋白质、核甘酸等大分子或其他粒子)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂
2、糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中,在电场的作用下,向其极性相反的电极方向按各自的速度进行泳动,使组分分离成狭窄的区带。区带电泳法可选用不同的支持介质,并用适宜的检测方法记录供试品组分电泳区带图谱,以计算其含量()。除另有规定外,各不同支持介质的区带电泳法,照下述方法操作。采用全自动电泳仪操作时,参考仪器使用说明书进行;采用预制胶的电泳时,参考各电泳仪标准操作规程进行;结果判断采用自动扫描仪或凝胶成像仪时,参考仪器使用说明书进行。第一法纸电泳法纸电泳法以色谱滤纸作为支持介质。介质孔径大,没有分子筛效应,主要凭借被分离物中各组分所带电荷量的差异进行分离,适用于检测核甘酸等性质相似的物质。1仪器装置包括
3、电泳室及直流电源两部分。常用的水平式电泳富装置如图,包括两个电泳槽A和一个可以密封的玻璃(或相应材料)盖B;两侧的电泳槽均用有机玻璃(或相应材料)板C分成两剖分;外格装有粕电极(直径0.50.8CnI)D;里格为可放滤纸E的有机玻璃电泳槽架F,此架可从槽中取出;两侧电泳槽A内的钳电极D经隔离导线穿过槽壁与电泳仪外接电源相连。的水平式电泳空装置电源为具有稳压器的直流电源,常压电泳一般在100500V,高压电泳一般在500IOOOOVo2.测定法(1)电泳缓冲液枸椽酸盐缓冲液(pH3.0):取枸椽酸(CcH8O7-H2O)39.04g与枸椽酸钠(CeH5Na3O72H0)4.12g,加水400Om
4、1使溶解。(2)滤纸取色谱施纸置1mo11甲酸溶液中浸泡不少于12小时,取出,用水漂洗至洗液的PH值不低于4,置60烘箱烘干,备用。可裁成长27cm、宽18CIn的滤纸,或根据电泳室的大小裁剪,并在距底边58cm处划一起始线,每隔2.53cm做一点样记号。(3)点样有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸椽酸盐缓冲液(pH3.0)中,湿润后,取出,用滤纸吸干多余的缓冲液,置电泳槽架上,使起始线靠近负极端,将滤纸两端浸入缓冲液中,然后用微量注射器精密点加供试品溶液,每点101,共3点,并留2个空白位置。干点法是将供试品溶液点于滤纸上,吹干,再点,反复数次,直至点完规定量的供试品溶液,然后
5、将电泳缓冲液用喷雾器喷湿滤纸,点样处最后喷湿,本法适用于浓度低的供试品溶液。(4)电泳于电泳槽中加入适量电泳缓冲液,浸没伯电极,接通电泳仪稳压电源,电压梯度调整为1820Vcm,电泳约1小时45分钟,取出,立即吹干,置紫外光灯(254nm)下检视,用铅笔划出紫色斑点的位置。(5)含量测定剪下供试品斑点以及与斑点位置面积相近的空白滤纸,剪成细条,分别置试管中,各精密加入0.0Imo1/1盐酸溶液5m1,摇匀,放置1小时,用3号垂熔玻璃漏斗滤过,也可用自然沉降或离心法倾取上清液,按各品种项下的规定测定滤液或上清液的吸光度,并计算含量。第二法醋酸纤维素薄膜电泳法醋酸纤维素薄膜电泳法以醋酸纤维素薄膜作
6、为支持介质。介质孔径大,没有分子筛效应,主要凭借被分离物中各组分所带电荷量的差异进行分离,适用于血清蛋白、免疫球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、类固醇激素及同工酶等的检测。1 .仪器装置电泳室及直流电源同纸电泳。2 .试剂(1)巴比妥缓冲液(pH8.6)取巴比妥2.76g、巴比妥钠15.45g,加水溶解使成IOOOm1。(2)染色液常用的有以下几种,可根据需要,按各品种项下要求使用。氨基黑染色液取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50m1、冰醋酸IOm1及水40m1的混合液中。丽春红染色液取丽春红9.04g、三氯醋酸6g,用水溶解并稀释至IOOm1。含有醋酸的丽春红染色液取丽春红0.1g,醋酸5m1用水制
7、成IOOm1的溶液。4保存。含有三氯醋酸和5-磺基水杨酸的丽春红染色液取丽春红2g,三氯醋酸30g,5-磺基水杨酸30g,用水溶解并稀释至IoOn1。(3)脱色液取乙醇45m1、冰醋酸5m1及水50m1,混匀。(4)透明液取冰醋酸25m1加无水乙醇75m1,混匀。3 .测定法(1)醋酸纤维素薄膜取醋酸纤维素薄膜,裁成2cmX8cm的膜条,将无光泽面向下,浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夹于滤纸中,轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上,置电泳槽架上,经滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(PH8.6)中。(2)点样与电泳于膜条上距负极端2cm处,条状滴加蛋白质含量约5%的供试品溶液23
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