羊栖菜酵素对小鼠肠道菌群结构和粪便差异代谢物的影响.docx

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1、摘要：为探究羊栖菜Sargassunifusiforme酵素对小鼠肠道菌群结构及粪便差异代谢物的影响，每日一次使用剂量为0.2m1/10g(体质量)的羊栖菜酵素对体质量为(252)g的雄性小鼠连续灌胃45d后，同时设灌胃相同剂量生理盐水的空白组，收集2组小鼠粪便，采用16SrRNA高通量测序技术对各组小鼠肠道菌群进行分析，同时采用UP1C-TOf-MS代谢组学对小鼠粪便代谢产物进行分析，确定代谢通路，并研究羊栖菜酵素与肠道微生物菌群之间的关系。结果表明：基于I11uminaMiSeq平台，与灌胃生理盐水的空白组相比，羊栖菜酵素灌胃组小鼠粪便中乳杆菌属IaCZo6acuS双歧杆菌属87d%c2e

2、”力等有益菌丰度升高，拟杆菌属Bacteroides幽门螺杆菌属TfeDoAacZer等有害菌丰度降低；采用UP1C-TOf-MS代谢组学分析确定了正负离子模式下，有14个与羊栖菜酵素灌胃相关的粪便显著差异代谢物，涉及7个主要相关代谢通路，分别为噂吟代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，嗒咤代谢,半乳糖代谢，精氨酸和脯氨酸代谢通路，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，精氨酸的生物合成,其中对前5个代谢通路的影响最为显著。研究表明，小鼠肠道中有益菌与致病菌比例在两组之间差异显著，羊栖菜酵素组中有益菌群比例均大于空白组，代谢产物也存在明显差异，羊栖菜酵素对小鼠的肠道菌群多样性具有调节作用。关键词：羊栖菜酵素

3、；小鼠；肠道菌群；代谢组学羊栖菜Sargassumfusiforme属于褐藻门马尾藻属的一种海洋抱子植物，以浙江、福建和辽宁沿海地区居多。中国药典早有记载，羊栖菜营养丰富，含有多种生物活性物质，如维生素、多酚类物质、多糖和蛋白质等，近年的研究表明，羊栖菜具有降血脂、抗疲劳、增强免疫力和延缓衰老的作用，因此，羊栖菜在医药、食品和化妆品等领域具有重要应用价值。酵素是一种发酵产物，能够参与机体新陈代谢等生命活动。酵素食品是指以各种蔬菜、水果等为原料，采用各种有益菌发酵剂进行发酵制成的产品，含有多种营养成分和各种微生物及其代谢产物，具有改善肠道功能、增强免疫力等特性。酵素发酵原料多种多样，水果、蔬菜是

4、酵素常用原料，除此之外，还可添加菌菇、中草药和藻类等进行发酵，制备多种酵素产品。近年来，学者对酵素产品的发酵工艺和功能性进行了较多研究，发现酵素食品普遍具有较好的抗氧化性和微生物多样性，且随着发酵程度的进行，酵素食品中的抗氧化性和微生物多样性呈现上升趋势。肠道菌群作为胃肠道内环境稳定的重要组成部分，在维持机体健康等方面发挥着重要作用。在机体消化吸收过程中，营养摄取可导致肠道微生物系统发生变化O研究表明，发酵食品会对机体肠道菌群多样性产生影响，同时，也会带来与机体糖分解有关的菌群改变、产短链脂肪酸(SCFAS)菌群丰度减小及蛋白质分解菌群增多等变化。羊栖菜酵素是用羊栖菜和果蔬经过多种菌种发酵得到

5、的羊栖菜酵素，含有丰富的营养成分，具有良好的抗氧化活性和微生物多样性。目前,关于羊栖菜酵素与肠道微生物菌群之间的作用关系尚不明确。酵素对小鼠肠道菌群影响是近年来关注的焦点，多项研究表明，酵素可能与肠道中的微生物群落构成有关，能抑制肠道致病菌，促进有益菌生长,优化肠道菌群结构，对健康产生积极意义。本研究中，以灌胃羊栖菜酵素和灌胃生理盐水的小鼠为研究对象，通过采集小鼠粪便对两组小鼠的肠道菌群差异性进行研究，并利用16SrRNA基因测序与代谢组学联合应用技术，研究羊栖菜酵素对小鼠肠道菌群结构和代谢产物的影响，旨在揭示羊栖菜酵素与肠道微生物菌群之间的关系。1材料与方法1.1 材料试验动物为SPF级昆明

6、种小鼠IOO只，雄性，体质量为(252)g,购自大连医科大学动物实验中心。试验小鼠饲养于室温为(253)C和湿度为40%60%的遮光室内鼠笼中，小鼠可自由饮水和取食。SPF级试验维持鼠粮购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司。试验动物许可证号SYXK(辽)2008-0002o主要仪器：ABTrip1eTOF5600/6600质谱仪(ABSCIEX)；Agi1ent1290Infinity1C超高压液相色谱仪(Agi1ent)；低温高速离心机(Eppendorf5430R)o色谱柱:ACQUITYUP1CBEHAmide1.7um,2.1mm100mmco1umn(Waters)；ACQUITY

7、UP1CHSST31.8um,2.1100mmco1umn(Waters)o1.2 方法1.2.1 羊栖菜酵素的制备按照杨培青等的方法加以改进，即将羊栖菜、苹果、梨、胡萝卜、冬瓜洗净并沥干，切成13cm见方的块状，取质量分别为15.0、1.0、0.5、0.5、0.5g混合，再将酵母、乳酸菌及醋酸菌加入混合物中，酵母、乳酸菌和醋酸菌的加入量均为混合物质量分数的0.5%,于发酵罐中1025C下发酵50d,即得羊栖菜发酵液。将所得羊栖菜发酵液过滤，滤液置于罐中贮藏30d,即得羊栖菜酵素。1.2.2 小鼠粪便的收集将100只昆明种小鼠随机分为空白组(contro1-1contro1-10)和羊栖菜酵素

8、组(JSTJST0),每组设10个重复，每个重复5只小鼠。每天上午分别用生理盐水(ContrOI)和羊栖菜酵素(JS)对各组小鼠进行灌胃，灌胃剂量均为0.2m1/10g(体质量)，每日一次，连续灌胃45do最后一次灌胃24h后，采用拎尾法收集各组粪便存放在离心管中，置于液氮中速冻后于-80C下保存备用。1.2.3 16SrRNA高通量测序及微生物多样性分析将冷冻的小鼠粪便采用干冰送样方法寄送至上海中科新生命生物科技有限公司，用于DNA的提取及测序，通过基因组DNA抽提、PCR扩增、荧光定量、I11uminaPE250测序将得到的PEreads根据OVer1aP关系进行拼接。对样品进行ChaO1

9、、Shannon、Simpson等A1pha多样性指数分析，并计算样品覆盖率。OTU数量代表物种的丰度，利用Mothur软件对每个样品的OTU数量(相似水平97%以上)进行计算。1.2.4 粪便代谢组学分析取冷冻的小鼠粪便60mg,分别加入200U1水MP匀浆，涡旋60s,加入800U1甲醇-乙月青溶液(二者体积比为1：1),涡旋60s,低温超声30min,2次，-20C下放置1h沉淀蛋白质，4下以14000r/min离心20min,取上清液冷冻干燥，于-80C下保存。样品采用超高效液相色谱系统(AgiIent1290Infinity1C)进行分离，色谱仪中柱温为25,流速为0.3m1min,

10、流动相为水+25mmo1/1乙酸铁+25mmo1/1氨水(A相)，乙睛(B相)，在进行梯度洗脱过程中，采用随机样本连续分析法进行检测和分析。1.2.5 代谢产物鉴定与分析代谢结构鉴定物的数据经Pareto-sca1ing预处理后进行多维统计分析，即P1S-DA有监督偏最小二乘法判别分析、无监督主成分PCA分析和OP1S-DA正交偏最小二乘法判别分析。结合相关数据库选取潜在差异标志物，结合相关生物标志物，采用MetPA数据库构建代谢通路，对数据进行分析解释。其中，使用OP1S-DA模型中变量重要性投影(Variab1eimportanceintheprojection,V1P)参数评价潜在的生物

11、标志物。选择具有多维统计分析VIP1和单变量统计分析网0.05的代谢物，作为具有显著性差异的代谢物。将筛选出的差异代谢物进行热图分析和利用Metaboana1yst数据库进行代谢通路分析。KEGG通路下包含的差异表达代谢物数目，在某种程度上反映试验设计中生物学处理对各个通路的影响程度，因此，结合两方面因素选择较为显著的代谢或信号转导途径及差异表达代谢物进行后续生物学机制研究。2结果与分析2.1菌群多样性分析从表1可见：在所有样品中，样品OTU数量最多的为羊栖菜酵素灌胃JS-5组和JS-6组(均为1319),最少的为JST组(602),表明各组菌群丰度存在显著差异；ChaO1值反映菌群多样性程度

12、，指数值越大表示菌群多样性越高，样品中菌群多样性程度最高的为JS-5组(1527)；Shannon指数反映菌群多样性程度，指数值越大表示菌群多样性越高，样品中Shannon值最大的组也是JS-5组(5.46)；Simpson指数也反映菌群多样性程度，数值越低表示菌群多样性越高，样品中JS-5组SimPSOn值最小(0.0107)；20个样品的覆盖率均在0.99以上,说明小鼠粪便样品中不能被检测到的可能性较低。因此，从20组小鼠粪便菌群的OTU数量及A1Pha多样性可以看出，羊栖菜酵素灌胃组小鼠粪便菌群多样性最高，表明羊栖菜酵素灌胃对小鼠的肠道菌群具有较为突出的调节作用。表1各组样品粪便菌群的O

13、UT数量及AIPha多样性Tab.1OUTnumbersandA1phadiversityoffeca1microbiotaineachgroupsamp1eIDreadsOTUChao1coverageShannonSimpsonJS-I445826028320.99573.500.0820JS-23066175910440.99204.340.0318JS-34327189211020.99464.120.0618JS-43734390512510.99244.050.0914JS-545806131915270.99435.460.0107JS-653077131914950.99565

14、.430.0132JS-7384527228860.99544.260.0379JS-84365683810410.99524.270.0373JS-94586192111620.99484.360.0352JS-IO5478295011740.99574.410.0306contro1_12868888210980.99215.010.0153contro1-24761397911870.99474.580.0233contro1_35732796611810.99594.460.0333contro1_45133783711030.99524.300.0413contro1_5379368

15、9110680.99465.180.0119contro1_6573778439950.99663.950.0506contro1_729458113313910.99025.230.0169contro1_85407978510120.99644.280.0341contro1_950316116914030.99464.930.0185contro1_104377095611710.99444.620.02432. 2菌群构成通过与数据库进行比对，对OTU进行物种分类并分别在门和属水平上对各个样品进行了分析。从图1可见:两组小鼠肠道微生物种类繁多，在门水平上主要有6大类，分别是厚壁菌门Firmicutes拟杆菌门BaCterOidetes、变形菌门ProteObaCteria、放线菌门Actinobacteria-细菌EPSi1OnbaCteraeota和脱铁杆菌门Deferribacteres,其中厚壁菌门和拟杆菌门是丰度比例最高的菌