波纹龙虾性腺抑制激素(GIH)基因克隆表达及其对光周期的响应.docx

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1、摘要：为探讨波纹龙虾Panu1irushomarus性腺抑制激素(gonadinhibitinghormone,G1H)基因PhG时的时空表达及其对不同光周期的响应，采用RACE技术克隆获得波纹龙虾眼柄组织G1H全长cDNA序列，通过卵巢颜色与形态、石蜡组织切片和性腺发育指数，比较不同光周期(121：12D、131：IID和141：IoD)对波纹龙虾卵巢发育的影响，采用qPCR技术检测波纹龙虾不同卵巢发育时期(增殖期、发育期和成熟期)、不同组织胸的表达情况及其对光周期的表达响应。结果表明：波纹龙虾G/的CDNA序列全长为1206bp,开放阅读框(ORF)为354bp,编码117个氨基酸，预测该

2、蛋白质包括39个氨基酸组成的信号肽和78个氨基酸组成的成熟肽，具有高血糖激素家族(CHH家族)II型肽激素的典型特征；同源性分析显示，波纹龙虾G1H氨基酸序列与非洲龙虾susaam”的一致性最高，为56.76%；系统进化分析显示，波纹龙虾G1H与非洲龙虾亲缘关系最近；qPCR结果显示，波纹龙虾GIH在各组织中广泛表达，其中眼柄中表达量最高(K001),677/在眼柄中的表达量随卵巢成熟而下降；光周期试验显示，采用141：IOD光周期处理92d时能更好地促进卵巢发育，波纹龙虾性腺发育指数(GSD显著升高(/K0.05),其眼柄G/表达量显著下降(/K0.05),石蜡组织切片观察显示，此时的卵巢为

3、橘红色，以成熟卵母细胞为主。研究表明，波纹龙虾67基因可能在波纹龙虾卵巢发育过程中起着重要作用，141：IOD光周期处理对卵巢发育促进效果最明显。关键词：波纹龙虾；性腺抑制激素；基因克隆；基因表达；光周期高血糖激素家族(CHH家族)，又称为CHH/MIH/GIH肽家族，是X器官-窦腺(Xorgan-sinusg1and,Xo-SG)中最丰富的一类肽激素，具有热稳定性，在调节血糖水平及调控生殖、发育和蜕皮等生理活动中起着关键作用。性腺抑制激素(gonad-inhibitinghormone,GIH)又称为卵黄生成抑制激素(Vite11Ogenesis-inhibitinghormone,VIH)

4、,是CHH家族中重要的一员，属于II型肽激素，由7287个氨基酸构成，具有酸性等电点、热稳定性等特点，相对分子质量为3000-11000o该激素由眼柄中X器官的神经分泌细胞分泌，经轴突神经束运送到窦腺暂时储存，之后进入血液循环，最终作用在肝胰腺、卵巢、大颗器和雄性的促雄性腺等组织。其既无种类特异性，也无性别特异性，具有抑制卵巢发育、雄性精巢发育与交配行为、大颗器官合成甲基法尼脂(MF,保幼激素类似物)及肝胰腺合成卵黄蛋白等作用。目前，关于67基因在斑节对虾PenaeusInOnOdon、日本沼虾Macrobrachiumnipponensis挪威海螯虾MR2psnorvegicus欧洲螯龙虾H

5、omarusgammarus等甲壳动物中的研究已经取得了不少进展。此外，有关光周期对龙虾性腺发育的影响也有一些报道，如Sach1ikidis等研究发现，锦绣龙虾Panu1irusornatus在夏季自然光周期条件下比冬季抱卵个数多，研究者认为光周期是龙虾性腺成熟和交配活动开始的主要因素。然而，有关波纹龙虾的相关研究报道则较少。波纹龙虾Panu1irushomarus隶属于十足目Decapoda腹胚亚目P1eocyemata龙虾科Pa1inuroidea龙虾属Panu1irusf是中国东南沿海的地方经济种类，是中国两大主要龙虾养殖品种之一，同时也是世界龙虾养殖的主要品种。波纹龙虾具有生长快、个体

6、大、抗病力强、经济价值高等优点。目前，中国海区龙虾资源缺乏，超过80%的龙虾需要从国外进口。虽然各地水产部门对开展龙虾人工养殖高度重视，但以捕捞天然龙虾苗种进行人工养殖的模式已无法满足市场的长期需求。因此,开展龙虾人工繁殖研究势在必行。目前，有关龙虾繁殖研究主要集中在营养、内分泌和生态环境等领域，对其分子生物学方面的研究较少。本研究中，利用CDNA末端快速扩增技术(rapidamp1ificationofcDNAends,RACE),基于广东海洋大学甲壳动物实验室提供的波纹龙虾眼柄转录组筛选克隆得到了必G小基因的全长CDNA序列，并进行了生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR(quantita

7、tiverea1-timePCR,qPCR)方法检测了该基因在波纹龙虾不同卵巢时期和不同组织的表达情况，并通过为期92d的光周期试验，研究了不同光周期对波纹龙虾卵巢发育的影响，利用qPCR检测眼柄G基因的表达情况，以期为该基因参与波纹龙虾性腺发育调控机制研究提供基础数据，同时也为龙虾的人工繁殖和甲壳动物CHH家族的研究提供新的材料。1材料与方法1.1 材料试验用波纹龙虾捕自中国海南省琼海市南海海区。选取体格均一、附肢完整、健康鲜活的波纹龙虾，在广东海洋大学东海岛生物研究基地暂养一段时间后用于试验。于2019年8月2日选取增殖期、发育期和成熟期3个不同卵巢发育时期的波纹龙虾在广东海洋大学甲壳动物

8、实验室进行基因(记为%G的克隆和时空表达分析。其中，波纹龙虾卵巢的发育阶段通过其卵巢色、形态、性腺发育指数(gonadosomaticindex,GSD和组织学特性进行分期。于2023年6月8日选取卵巢发育时期为增殖期、平均体质量为123.5g的波纹龙虾在广东海洋大学东海岛生物研究基地进行光周期试验。试验期间，波纹龙虾投喂近江牡蛎CraSSOS5eazP7a/和波纹巴非蛤PaphiaUndu1ateo基因克隆及组织表达试验选取眼柄、心脏、脑、肝胰腺、卵巢、肠、鳏等组织样品；光周期响应试验选取眼柄组织用于基因检测，卵巢组织经体积分数4%的多聚甲醛固定后用于石蜡组织切片观察。将波纹龙虾解剖后,用于

9、基因克隆及检测的组织样品装入有RNAIater试剂(ThennOSCientifiC)的冻存管中，之后放置于4C过夜，再转移至-80下保存备用。主要试剂盒：SanPreP柱式DNA胶回收试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；反转录试剂盒(EaSySCriPtOne-StepgDNARemova1andcDNASynthesisSuperMix)、实时荧光定量试剂盒(PerfectStartGreenqPCRSuperMix)TransZo1UpP1usRNAKit和DH5感受态细胞，均购自北京全式金生物技术有限公司；PMD-19T载体试剂盒和SMARTer-RACE试剂盒，购自TaKa

10、Ra公司。1.2 方法1.2.1 引物设计应用Primer5.O软件，根据波纹龙虾眼柄转录组筛选得到的一条与短沟对虾PenaeusSemisu1catus6/基因高度同源的1182bp的EST序列，设计该基因片段序列克隆引物和RACE特异性引物。根据%G，开放阅读框(OPenreadingframe,ORF)片段和眼斑龙虾-四力序列(GenBank登录号:GQ865599.1)设计实时荧光定量PCR(qPCR)引物。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各引物及其序列如表1所示。表1试验用引物及序列Tab.1Primerandsequencesusedintheexperiment引

11、物序列（5-3primerscqucnce（5,-3,）用途functionGIH-FGGCGACACCCCCTTGCCTGATGiH-RGtccccaaggtttcagcctactccG/H-5,-outerATCGTGGATGCGGATGTCAGGAGIH-5,-innerGTGTCGCTGGTCAACTTCCTTCG片段序列5,RACEGH-3,-outerGCCCATGATCTAACAACCATCAGGT3,RACEGIH3inner（；CCCATAAACCAT（；CCA（；ATAACA（；g/h-qPCR-FAcaattacttcttcgtgtgcctGH-qPCR-RAccatcg

12、tccagcgtttag-actin-FCCATCCAGGCTGTGCTCTCT-actin-RGCGGTGGTTGTTGAGGTGMi3-FCgccagggttttcccagtcacgacmi3-rAgcggataacaatttcacacaggaqPCRqPCR菌液PCR检测1.2.2总RNA提取及cDNA的制备采用TransZo1UpP1usRNAKit提取上述样品的总RNA,用10g/1琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，经Nanodrop2000超微量核酸测定仪(ThermOSCientifiC)检测其浓度和纯度。将上述样品所得总RNA按照反转录试剂盒说明书进行反转录，所得CDNA用于后续的q

13、PCR模板，于-20C保存备用。将眼柄总RNA分别按照反转录试剂盒与SMARTerRACE试剂盒说明书制备得到用于片段序列克隆的模板cDNA和RACE的模板cDNAo1.2.3 GM基因的全长cDNA克隆将用于片段序列克隆的眼柄CDNA作为模板，利用引物67FR（表1）进行PCR技术扩增，得到包含该基因ORF的中间片段序列。以该中间片段序列为模板，设计5RACE和3,RACE的特异性引物和巢式引物。将用于RACE的眼柄cDNA作为模板，通过RACE技术和巢式PCR技术扩增目的基因的3末端。第一轮PCR引物使用GIH-V-outer（表D和接头通用引物UPMo反应条件：98下循环变性10s,59

14、.1下退火复性5s,72下延伸5s,共进行30个循环；72下再延伸5mino取PCR产物0.5R1进行巢式PCR,引物使用GIH-V-inner（表1）和接头通用引物NUP。反应条件:95C下预变性5min；95下循环变性30s,58.3C下退火复性30s,72下延伸Imin,共进行30个循环；72C下再延伸Iomin。目的基因的5末端扩增与上述方法一致。用10g/1琼脂糖凝胶电泳检测巢式PCR扩增产物。切胶回收目的条带后与pMD-19T载体4C下连接过夜，然后转化至DH5大肠杆菌感受态细胞中，将转化后的菌液均匀涂布于含氨芾的固体培养基上，并倒置于37C培养箱中培育12ho之后筛选阳性克隆送生

15、工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。1.2.4 %G/序列分析及系统进化树的构建利用DNAMAN软件对测序结果序列进行拼接，获得G基因的全长cDNA序列。通过NCBI网站查找ORF序列，将预测的氨基酸序列与蛋白质数据库进行相似性比对分析；利用ExPASyProtParam(https:/web.expasy.orgprotparam)和ExPASyProtSca1e(https:/web.expasy.orgprotsca1e)预测蛋白质的理化性质和亲水性；利用PSORTIIPrediCtion(http:PSort.hgc.jpform2.htm1)预测亚细胞定位；利用Signa1P5.

16、0软件Server(http:/www.cbs.dtu.dkservicesSigna1P/)预测信号肽；利用TMHMMServer2.0软件(http:/www.cbs.dtu.dkservices/TMHMM)进行跨膜结构域分析；利用SMART4.0软件(http:SnIart.emb1-heide1berg,de)进行蛋白质结构域分析；利用SOPMA(https:/npsa-prabi.ibcp.frcgi-bin/npsa_automat.p1?page=/NPSA/npsa_sopma.htm1)进行二级结构分析；利用SWISS-MO1DE1(http:/www.swissmode1.expasy.Org/)预测三级结构