尼罗罗非鱼CD209基因的克隆表达及功能鉴定.docx

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1、摘要:为揭示尼罗罗非鱼模式识别受体CD209的分子结构、组织表达特性并初步了解其免疫功能，利用聚合酶链式反应(PCR)获得尼罗罗非鱼OreochromisZoicus(体质量为100g5g)CQ209基因的开放阅读框片段(OPenreadingframe,ORF),命名为6C209;使用生物信息学软件对其氨基酸序列进行分析，采用RTfPCR法对健康尼罗罗非鱼的各组织及无乳链球菌刺激后尼罗罗非鱼肝脏、脾脏、鲤和肠道的或09基因表达量进行分析,并构建了6Z209-pEGFP-N1及A9209-pcDNA3.1载体，研究了CEO9基因在293T细胞中的定位及在细胞中过表达时对NF-B酶活性的影响。结

2、果表明：如209的ORF区片段长度为1383bp,可编码460个氨基酸，预测该蛋白具有一个C型凝集素结构域；多重氨基酸序列比对及系统进化分析显示，CD209氨基酸序列在各物种间相对不保守，尼罗罗非鱼与田纹狮子鱼pms功/闻e的CD209氨基酸序列聚为一支，亲缘关系最近；RJqPCR结果显示，所有组织(脑、血液、皮肤、肌肉、头肾、肠道、鲤、肝脏、脾脏和胸腺)中均能检测到0nCD的mRNA表达，且在血液中表达量最高；尼罗罗非鱼在受到无乳链球菌感染后，如209的表达在各组织中呈现相似的变化趋势，大致呈先在6h时上调，后在12、24h时下调，再在48h后上调的表达模式；亚细胞定位分析显示，%或09定位

3、于细胞膜上；双荧光素酶报告基因系统检测发现，应0209对NF-kB通路的活性显著性激活。研究表明，%或09可能参与尼罗罗非鱼对细菌的免疫应答过程及炎症反应过程。关键词：尼罗罗非鱼；模式识别受体；荧光定量PCR；基因克隆；亚细胞定位；NF-B先天免疫是免疫防御机制的第一道防线，在脊椎动物和无脊椎动物中对外来病原体具有重要的防御功能。在低等脊椎动物硬骨鱼中，先天免疫系统在保护生物体免受病原体入侵方面发挥着关键作用。机体通过模式识别受体(patternrecognitionreceptors,PRRS)识别细菌、真菌和病毒等病原体，使自身免受病原体侵害，其中，To11样受体(to11-1ikerec

4、eptors,T1Rs)、NoD样受体(NoDTikereceptors,N1Rs)RIG-I样受体(R1G-I1ikereceptors,R1Rs)和C型凝集素受体(C-type1ectinreceptors,C1RS)在识别病原体相关分子模式的先天免疫中起着重要的作用。CD209又称为树突状细胞特异性细胞间黏附分子3结合的非整合素(dendriticce11-specificinterce11u1aradhesionmo1ecu1e-3-grabbingnonintegrin,DC-SIGN),是模式识别受体C型凝集素家族的成员，其既能激活初始免疫反应，又能抑制免疫反应，具有正负免疫调节作

5、用，近年来该研究较受关注。研究者最初研究树突状细胞(dendriticce11,DC)在人类免疫缺陷病毒(HIV)感染过程中的作用时发现，CD209是树突状细胞膜上的一种C型凝集素，可以和T细胞表面的细胞间黏附分子3(1CAM-3)相互作用，介导DC细胞与T细胞的原始黏附，后来研究发现，CD209可在DC黏附迁移及炎症反应、激活初始T细胞并启动免疫应答及病原体与肿瘤逃逸等诸多方面发挥着重要作用oCD209主要在DC和巨噬细胞的表面表达，可参与细胞相互作用的调节和模式识别。目前，关于CD209的研究主要集中在人和小鼠，而对于鱼类的CD209和DCs的研究报道较少。研究表明，斑马鱼在受到钉形贝血蓝

6、蛋白(keyho1e1impethemocyanin,K1H)或嗜水气单胞菌刺激后，通过干扰CD209的表达可以显著抑制T细胞活化、抗体(IgM)的产生和细菌免疫保护，这表明CD209在适应性免疫的启动和发展中发挥至关重要的作用。此外，在病原感染后，半滑舌鲸肾脏和血液中的CD209表达显著上调，且CD209蛋白能显著促进半滑舌鳗白细胞对细菌的吞噬作用,这表明CD209在病原体感染过程中发挥着重要作用。尼罗罗非鱼Oreochromis1oZcus为中国重要的经济鱼类之一。近年来，随着养殖规模的不断扩大，高密度养殖和水体污染等原因导致罗非鱼疾病大规模暴发,给水产养殖业造成了巨大的经济损失。尤其是近

7、年来新发现的罗非鱼湖病毒，已对厄瓜多尔等国家的罗非鱼养殖造成了巨大损失，因此，有关罗非鱼先天免疫防御系统的研究可为病害的控制提供帮助。目前，关于以09在尼罗罗非鱼中的作用未见报道，其在尼罗罗非鱼疾病的发生、发展中的作用机理尚不清楚，为此，本研究中对尼罗罗非鱼或09基因(诙或09)进行了克隆及序列分析，检测了或09在各组织中的表达情况及无乳链球菌感染后的表达模式，并分析了6X209在细胞中的定位情况及其在细胞中过表达时对NK-B(nuc1earfactorkappa-1ight-chain-enhancerofactivatedBce11)通路的影响，以期为进一步研究罗非鱼Cm09的生物学功能提

8、供理论基础。1材料与方法1.1 材料试验用健康尼罗罗非鱼（体质量为IOOg5g）购自广东省湛江市湖光镇的某渔场。无乳链球菌是广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室从患病尼罗罗非鱼体内分离保存的菌株（ZQ1901）。实验室常规基因克隆相关试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司，RNA提取、CDNA合成及荧光定量相关试剂购自北京全式金生物公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自碧云天生物公司，引物合成和测序均由广州生工生物有限公司完成。1.2 方法1.2.1 试验设计及饲养管理试验开始前，将尼罗罗非鱼于实验室条件下暂养2周，暂养于IoOO1的充氧水箱，每个水箱养殖200尾尼罗罗非鱼，水温

9、控制在28左右，每日早晚各投喂一次饲料（恒兴罗非鱼膨化饲料106）,每3日换一次水，每次排掉1/2养殖水后再注入新水，并利用虹吸法清理缸内排泄物。试验开始前，随机抽检一些尼罗罗非鱼的脾脏、头肾、肝脏等组织，验证是否含有病原微生物。对鱼体解剖取其组织前使用丁香酚麻醉处理，所有的处理均符合广东省试验动物福利相关规定。1.2.2尼罗罗非鱼总RNA的提取及以09开放阅读框的克隆采用TR1ZO1UP方法提取尼罗罗非鱼脾脏总RNA,将脾脏组织置于2In1的无RNA酶EP管中，加入1m1的TRIZ01UP及钢珠一个，使用研磨器研磨3min；将200U1氯仿加入组织匀浆中，充分震荡，混合液于4C下以12000

10、r/min离心15min,将分层后的上层水相转移至15m1无RNA酶的EP管中；加入等体积提前预冷的异丙醇，室温静置10min；离心后弃上清液，加入500U1体积分数75%的乙醇，温和震荡后以8000r/min离心5min,弃上清液，室温下晾干10min,然后加入无RNA酶的水溶解RNA样品，使用超微量生物检测仪检测其浓度，并用琼脂凝胶电泳检测提取的RNA质量。使用全式金公司的反转录试剂盒进行第一链CDNA的合成，产物于-20下保存待用。使用Prime5.0设计一对引物(或09-F:Atgagtgtcgagtaccatgcatcc,或09-r：Ctacatctcacagatccagttttgt

11、tc),以脾脏的第一链CDNA为模板，进行或09开放阅读框(OPenreadingframe,ORF)片段的克隆。PCR反应体系供201):ExTaq酶101,CDNA模板11,或09-F/R各1u1,dd07U1oPCR反应程序：95预变性5min；95C下循环变性30s,60C下退火复性30s,72下延伸50s,共进行35个循环；最后再在72C下延伸5mino通过琼脂凝胶电泳检测PCR产物条带大小与理论值是否相符，然后对PCR产物进行纯化，将纯化后的PCR产物转入PMDT8T克隆载体，涂板挑菌后进行菌落PCR检测，挑取阳性克隆送至广州生工生物有限公司进行测序。1.2.3OnCD1序列分析测

12、序结果采用DNAMAN进行拼接，用美国生物技术信息中心(NCBDBIaSt在线程序进行序列比对。用ORFFinder程序(http:/www.ncbi.n1m.nih.gov/orffinder/)分析6feG9209潜在的开放阅读框架。利用在线软件ExPASy-ProtParam工具(https:/web.expasy.Orgprotparam)对氨基酸序列、分子量和理论p1进行预测。使用在线程序ExPASY(http:ca.expasy.org)和SMART(http:/smart,emb1-heide1berg.de)获得氨基酸序列和结构域信息,在NCBI的资源库中对多个物种的CD209

13、蛋白进行选择,然后采用C1usta1X2.0、GeneDOC和DNAMAN进行多重序列比对分析，采用MEGA5.O软件构建系统发育树。1.2.4 %或09基因的组织表达从实验室暂养的健康尼罗罗非鱼中随机抽取5尾，于无菌条件下进行解剖，分别取肝脏、脾脏、头肾、鲤、肠道、胸腺、皮肤、肌肉、血液和脑10个组织，分别放入无RNA酶的2m1EP管中进行组织研磨后，提取RNA并反转录成cDNA,方法同“12.2节”。采用RT-qPCR法检测10个组织209基因的表达情况,设计一对荧光定量引物(q或09-f：Tgtttactcctcttggctggtg,q209-R：AGCT-Tatctgcgtatcccg

14、ttt)oPCR反应体系(共iout)：MiX5.0u1,ddH.03.5u1,CDNA模板0.5u1,qQ209-F/R各0.5u1。反应程序为：95C下预变性30s；95下循环变性15s,60C下退火复性15s,72C下延伸20s,共进行30个循环。对每份样品的或09和力表达量进行检测，每个样品设置3个重复，采用23法计算基因相对表达量。1.2.5 无乳链球菌刺激后OnCD1基因的组织表达采用RT-qPCR法(使用罗氏1ightCyc1er96实时荧光定量PCR仪)检测注射无乳链球菌后%或09基因的表达量。病原刺激如下：将-80C下保存的无乳链球菌解冻后取出15m1接种于100m1的BH1

15、培养基中，于37C条件下培养至ODi为1O后，收集于离心管内，用PBS悬浮细菌浓度至IX10CFUm1,而后吸取100U1菌液对尼罗罗非鱼进行腹腔注射。在注射后0、6、12、24、48、72、96h采集组织样本，并进行RNA提取和CDNA合成，方法同“1.2.2节”。然后以合成的CDNA为模板，分别对所提取的组织样品进行RT-qPCR检测，反应体系和反应程序同“1.2.4节”。对每份样品CaO9和-】力表达量进行检测，每个样品设置3个重复。1.2.6 66Z209在293T细胞中的亚细胞定位设计一对引物(G9209-pEGFP-N1-F:CCGGAATTCTATGAGTGTCGAGTACCAT

16、G,209-pEGFP-Ni-R：Cggggtaccctacatctcacagatccag),以尼罗罗非鱼的脾脏CDNA为模板进行基因克隆，PCR产物纯化后，使用相同的限制性快切酶对PCR产物及PEGFP-N1进行双酶切处理，酶切产物纯化后使用T4连接酶进行产物与载体连接，然后转入DH5感受态细胞中，涂板挑菌，将阳性菌落送至广州生工生物有限公司进行测序，测序正确的菌液进行去内毒素质粒提取。将293T细胞接种于12孔细胞培养板内，当细胞增殖至密度为80%90%时，根据1ip3000使用说明书，将构建好的209-pEGFP-N1或PEGFP-N1表达载体转染至细胞内。将酒精浸润的圆形盖玻片于火上烤至干燥后放入12孔板内，使用胰酶对转染24h的细胞进行消化处理后，加入培养基混合物(10%的胎牛血清、1%的青霉素链霉素混合液及M199培养基)悬浮细胞并转入含盖玻片的细胞培养板内，试验设3个重复。培养5h