基因组Ⅰ型和Ⅴ型传染性胰脏坏死病毒的分离与鉴定.docx
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1、摘要:为调查造成中国西北某虹鱼尊Oncorhynchusnykiss养殖场幼鱼出现持续性死亡的病因,采用组织病理切片观察及分子鉴定的方法对患病虹酶进行了鞋鳞常见病毒筛查,同时采用系统发育分析、电镜观察、滴度测定及人工回归感染等方法对分离获得的毒株进行了基因型分析、显微结构观察及毒力特性分析等研究。结果表明:患病虹鳞的肝、脾及肾组织细胞发生广泛性坏死,并伴随空泡化及溶解等现象;由病鱼内脏组织制备的组织匀浆悬液均能够感染CHSE-214细胞并产生典型细胞病变(CPE);从该养殖场的不同养殖区域共分离到3株传染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreaticnecrosisvirus,IPN
2、V),其中IPNV-F1和IPNV-W2属于基因组I型,分别与IPNV中国分离株WZ2016(KX355401)和ChRtnI213(KX234591)同源性最高,VPZ基因片段序列一致性分别为100%和98.5%,IPNV-W1属于基因组V型,与意大利毒株IPNV/0吸公5/1犷208八&88。垢543567)同源性最高,二者的勿2基因片段序列一致性为99.1%;接种病毒后的CHSE-214细胞内存在大量呈晶格状排列的无囊膜病毒粒子,3株IPNV分离株在CHSE-214细胞上的平均滴度分别为10”TCIDO.11(IPNV-F1),10-TCIDO.1m1(IPNV-W1)10-TCIDO.
3、1m1(IPNV-W2);分别以0.1m1尾的剂量向健康虹蹲幼鱼腹腔注射各IPNV分离株,在攻毒后60d内虹蹲未出现死亡,攻毒后30d时,病毒在组织中的平均滴度分别为10-TCIDO.1g组织QPNV-F1)、10-TCIDO.1g组织(IPNVTD和10TCIDO.1g组织(IPNVT2),攻毒后60d时,病毒在组织中TCIDO.1的平均滴度下降为IOyTCIDO.1g组织QPNV-F1)、3g组织(IPNVT1)和10-TCID0.1g组织(IPNV72)。研究表明,该发病养殖场同时存在基因组I型和V型的IPNV,本研究首次从同一养殖场分离到两种基因型的IPNV,可为中国传染性胰脏坏死病Q
4、PN)的防控提供参考。关键词:虹醇;传染性胰脏坏死病毒;基因组I型;基因组V型虹鲤Oncorhynchusmykiss是中国主要冷水鱼养殖品种,广泛分布在中国东北、西北、西南等冷水资源较发达的地区,在带动当地经济发展、促进渔民增收方面发挥了积极的作用。随着养殖规模的扩大、苗种的频繁流通,虹醇病害频发,严重制约了冷水鱼养殖业的绿色健康发展。传染性胰脏坏死病(infectiouspancreaticnecrosis,IPN)是一种全球流行性疾病,于20世纪50年代在美国开始流行,至今已传播到法国、土耳其、智利、墨西哥、芬兰、挪威、西班牙、日本、韩国和伊朗等国家,给鱼圭蹲鱼养殖业造成了较大的经济损失
5、。该病是由传染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreaticnecrosisvirus,IPNV)引起的一种病毒性疾病,主要威胁能科鱼类。IPNV隶属于双RNA病毒科Birnavirdate水生双RNA病毒属Aquabirnavirus,其病毒粒子无囊膜包裹,呈二十面体。IPNV的基因组由A和B两条RNA组成。A链包含两个重叠的开放阅读框(OPenreadingframe,ORF),其中较大的ORF编码外衣壳蛋白VP2、内衣壳蛋白VP3和蛋白酶VP4,小ORF编码非结构多肽VP5oB链编码RNA依赖性RNA聚合酶VP1,用于转录和复制病毒基因组。利用交叉中和测定法可将水生双RNA病毒
6、分为A和B两个血清群(SerOgrOUP),其中,血清群A包含9种血清型,即A1(WestBuxton,WB)、A2(Spajarup,Sp)、A3(Abi1d,Ab)、A4(Hecht,He)A5(Te11ina,Te)、A6(Canada1,C1)A7(Canada2,C2)、A8(Canada3,C3)和A9(Jasper,Ja),血清群B仅具有血清型B1。利用系统发育分析方法,可将水生双RNA病毒分为7个基因型,包括基因组IV(genogroupIV)目前IPNV基因型主要分布在基因组IVI。中国于20世纪80年代首次暴发IPN疫情。该病在中国已经流行了30余年,造成了巨大的经济损失,
7、成为制约中国鞋蹲鱼产业发展的重要疫病之一。已知的中国境内分离的IPNV为基因组V型和基因组I型。2023年,中国西北某虹鳄养殖场幼鱼发生持续性死亡,死亡历程延续4个月之久,累计死亡率近20虬为探究造成虹醇幼鱼死亡的病因,本研究团队开展了流行病学调查工作,本研究中对患病虹鳞进行了组织病理学观察,对病原进行分离鉴定,并进行了病毒分离株的系统发育分析、电镜观察及人工回归感染试验,以期为虹蹲养殖业中的疾病防控提供参考。1材料与方法1.1 材料大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(ChinOoksa1monembryoce11s,CHSE214)和胖头觞上皮细胞(epithe1iomapapu1osumcyprini,
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