基于UPLCMS方法的品质易逝期活品虾夷扇贝代谢组学研究.docx

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1、摘要:为探索易逝期贝类活品品质变化机制，以壳长(I1010.31)cm的虾夷扇贝力力opec杷yessoes，s为研究对象，基于超高效液相色谱-质谱(UP1C-MS)的代谢组学方法研究了其湿藏条件下的代谢特征，试验设活品虾夷扇贝对照组(A)和湿藏组(C),并对虾夷扇贝闭壳肌的pH、糖原及代谢组学进行分析。结果表明：捕后湿藏的虾夷扇贝闭壳肌PH和糖原水平变化不大；经多元统计分析，品质易逝期湿藏36h的虾夷扇贝闭壳肌中共检测出7个显著性差异代谢物，分别为二十二烷酸(behenicacid)、酪胺(tyramine)、脯氨酰谷氨酸(PrO1y1-g1utamate)、二磷酸腺甘葡萄糖(ADP-g1u

2、cose)、尿首5-二磷酸(UDP).3-磷酸丝氨酸(3-phosphoserine)和柠檬酸(Citrate)；通路分析显示，三段酸循环(TCACyCIe)是最易受影响的代谢通路。研究表明，品质易逝期湿藏36h条件下的活品虾夷扇贝与初始扇贝相比，传统理化指标变化不大，但其代谢组存在显著性差异，说明代谢组学方法可较为灵敏、全面地反映活品虾夷扇贝湿藏期间的实时状态。关键词：虾夷扇贝；代谢组学；UP1C-MS；品质易逝期；闭壳肌；湿藏虾夷扇贝Patinopectenyessoensis是中国重要的贝类经济养殖品种之一，据统计，2019年中国养殖贝类产量达1457万t。活品虾夷扇贝作为一种高端海产品

3、，其品质一直备受关注，对捕后活品虾夷扇贝品质评价模式与变化机制的探究有助于提升产品品质，促进贝类产业发展。从海上采捕至陆基加工净化前为贝类的品质易逝期(qua1itydeterminationperiod,QDP),根据本团队多年的调研与实践发现，该阶段的环境变化及处置方式对于后续活品贝类的品质贮藏稳定性具有十分重要的影响，且存在明显的延迟效应。因此，有必要对品质易逝期虾夷扇贝活品的代谢特征与品质变化进行探究。扇贝的风味品质与其生理状态密切相关，在活品贝类市场，扇贝开口率、闭合灵敏度及外套膜缩边等常常能够反映扇贝质量的好坏。生化指标如pH、糖原、ATP关联物、4值等也被广泛用于贝类活力的评价。

4、此外，游离氨基酸、水溶性蛋白及免疫因子等亦可作为扇贝品质评价指标。然而，这些传统的感官评价或单一理化指标往往灵敏度不够、品种针对性不强。目前，尚缺乏分子水平上虾夷扇贝代谢特征的全面分析。代谢组学(metabo1omics)是考察生物细胞、组织、器官或者生物体在不同状态下小分子物质种类、数量及其变化规律的科学。其主要研究手段包括核磁共振谱(NMR)、气相色谱-质谱(GC-MS)和液相色谱-质谱(1C-MS)等方法，其中，超高效液相色谱-质谱(UP1C-MS)具有灵敏度高、选择性好、信息丰富等优点，被广泛应用于代谢组学研究中。多元统计分析方法用于代谢组学的数据降维与信息挖掘，主要包括无监督的主成分

5、分析法(PCA)与有监督的偏最小二乘法判别分析(P1S-DA)、正交偏最小二乘法判别分析(OP1S-DA)等。近年来，代谢组学作为一种行之有效的方法应用于水产品的生理变化研究，如PiIditCh等研究了温度波动和食物供应对幼龄海扇贝/VacopecZe/?Rage/dzCUS生长和代谢的影响；Chen等运用代谢组学方法研究了半无水保存期间栉孔扇贝Ch1amysZkrrerf的生理变化；RoChfort等发现代谢组学方法可能有助于确定贻贝的产地；刘佳琳等研究了褐牙鳏Para1ichthyso1ivaceus幼鱼全组织在低盐胁迫后的代谢组变化。本研究中，以虾夷扇贝为研究对象，利用UP1C-MS代谢

6、组学技术,将捕后早期设定为36h之内，分析了品质易逝期湿藏条件下虾夷扇贝闭壳肌的差异代谢物及代谢途径，探索了湿藏条件下活品虾夷扇贝的代谢模式，以期为活品贝类代谢组数据的准确分析提供参考依据。1材料与方法1.1 材料试验用虾夷扇贝于2019年12月购自大连市长兴水产品市场，壳高为（I1370.30）cm,壳长为（I1010.31）cm,壳宽为（2.270.08）cm,均为当日到货，采用泡沫箱密封（碎冰降温），于Ih内运至实验室，立即进行分选和贮藏处理，剔除活力弱或死亡的虾夷扇贝。试验在辽宁省水产设施养殖与装备技术工程研究中心循环海水系统中进行。仪器设备：精密电子天平（BS224S型，北京赛多利斯

7、仪器系统有限公司）；离心机（Z326K型，德国HERM1E1abortechnikGmbH公司）；超高压液相色谱仪（AgiIent1290Infinity1C,美国AgiIent公司）；质谱仪（TriPIeTOF5600,美国ABSCIEX公司）；WatersACQUITYUP1CBEHAmide（2.1mm100mm,1.7UnI）色谱柱（美国WaterS公司）；PH计（PBT0,德国Sartori-us公司）；水纯化系统（Mi11i-Q,美国Mi11ipore公司）。试剂：乙月青、甲醇、氨水为色谱级（德国MerCk公司）；乙酸镂为色谱级（德国Sign1a公司）。1.2 方法1.2.1 试验

8、设计及采样处理运抵至实验室的虾夷扇贝活体原料处于急骤应激状态，立即置于循环海水系统中进行24h缓冲，循环海水为经3次沉淀的自然海水，海水体积为0.91nr,溶解氧质量浓度为6.3mg/1,温度为6.9缓冲后的扇贝作为模拟捕后的初始状态，即湿藏0h,设为对照组(A)；在海水中继续湿藏36h,可看作虾夷扇贝品质易逝期阶段，设为湿藏组(C)。每组取10只扇贝用于代谢组学分析。此外，分别于湿藏0、3、6、12、24、36h,从各组每个时间点取3只扇贝用于PH和糖原含量分析。活贝样品经手工开壳，将闭壳肌与其他软体组织分离，取闭壳肌中心部位肌肉，立即用液氮处理后于-80C超低温冰箱中保存。1.2.2 生化

9、指标的测定参考田元勇等的方法。试验设3个重复,每只扇贝取2.0g虾夷扇贝闭壳肌，加入浓度20mmo1/1的碘乙酸钠10m1,冰浴下用玻璃棒捣碎，静置25min,冰浴条件下测定闭壳肌pH。参考刘慧慧等的方法。试验设3个重复，每只扇贝取2.0g闭壳肌，加入质量分数30%的氢氧化钾溶液，沸水浴中加热20min,冷却后加入20m1无水乙醇，并在3000g条件下离心15min,取沉淀。采用意酮比色法于620nm下测定吸光度，计算葡萄糖含量，糖原含量为葡萄糖含量的1II倍。1.2.3 代谢组学分析1)样品处理。试验设10个重复,每只扇贝样品取100mg闭壳肌，在液氮下研磨后，加入8001甲醇-乙懵-水(体

10、积比为2：2：1)涡旋混匀，4C下超声2次，每次30min,然后在-20下孵育1h沉淀蛋白质，4、13000g条件下离心15min,取上清液冻干后于-80超低温冰箱中保存备用。质谱分析时加入100U1乙月青水溶液(乙睛与水的体积比为1：D复溶,4下涡旋振荡，以14000g离心15min,取上清液进行分析。为了对本次试验进行质量控制，制备了所有样品等量混合的样本(QC样本)，用于平衡色谱-质谱系统及测定仪器状态，并用于整个试验过程中系统稳定性的评价。2)1C-MSMS分析。色谱分离：色谱流动相A为水+25mmo1/1乙酸钱+25mmo1/1氨水，流动相B为乙盾，色谱梯度洗脱程序如表1所示。整个分

11、析过程中样品置于4自动进样器中，进样量为10u1,WatersAcquityBEHAmide(2.1mm100mm,1.7UnI)色谱柱，柱温为25C,流速为03m1/min；样本队列中插入QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及试验数据的可靠性。表1HP1C梯度洗脱程序Tab.1Gradiente1utionprogramforHP1C时间mintime流动相A/%mobi1ephaseA流动相B%mobi1ephaseB05950.55957.035659.0604010.0604011.I59516.0595质谱采集：采用电喷雾电离(ESD进行正离子和负离子模式检测。条件如下：干燥气为60

12、,辅助加热气为60,气帘气为30,毛细管温度为600,离子喷雾空载电压为5500V；扫描范围为60000-1200OOO(相对分子质量)，扫描积累时间为0.15s；二级质谱采用高灵敏度模式，扫描范围为25000-1200OOO(相对分子质量)，扫描积累时间为0.03s,去簇电压为60V,碰撞能量为30eV,IDA模式，同位素排除4000之内，离子监测周期6。13数据处理UP1C-MS分析的原始数据经ProteoWizard转换成.mzXM1格式，然后采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。对XCMS提取得到的数据，删除组内缺失值50%的离子峰，应用软件SIMCA-P14.1(Um

13、etrics,Umea,SWeden)进行模式识别,数据经Pareto-SCa1ing预处理后，进行多元统计分析，包括无监督的主成分分析(PCA)及有监督的偏最小二乘法判别分析(P1S-DA)、正交偏最小二乘法判别分析(OP1S-DA)等。代谢物结构鉴定通过峰的保留时间、精确质量数匹配(0.05)oThemeanswithdifferent1ettersaresignificant1ydifferentinthegroupsatthe0.05probabi1ity1eve1,andthemeanswiththesame1etterarenotsignificantdifferences.图1品

14、质易逝期湿藏条件下虾夷扇贝闭壳肌的PH与糖原含量Fig.11eve1sofpHandg1ycogenofYessosca11opPatinopectenyessoesisunderimmersionduringQDP2.2代谢组学分析2.2.1多元统计分析通过1C-MS/MS质谱检测，正离子模式下共获得了8844个峰，在负离子模式下共获得了8692个峰。将QC样本正、负离子检测模式下的质谱总离子流图(TIC)分别进行谱图叠加比较，各色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠(图2(a)、(b)；将所有试验样本和QC样本提取得到的峰，经Pareto-Sca1ing处理后进行PCA分析,经7次循环交互验证

15、得到PCA模型，图中的QC样品紧密聚集，说明整Fig. 2 个试验过程中仪器误差引起的变异较小,试验数据可靠(图2(c)、(d)。Fig. 3 TICover1apmapofQCsamp1esandPCAscorep1otofsamp1es,CandQC去除QC样本，将对照组(A)与湿藏组(C)的样品进行PCA分析，结果显示，正负离子模式下，所有样本均出现在HOteningT95%置信区间的椭圆内，说明两组样本不存在异常值(图3),然而在PCA下组间样本并无良好的区分。采用有监督的偏最小二乘法判别分析(P1S-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OP1S-DA)对两组样本进行进一步分析。结果显示，在两种模式下，虾夷扇贝A、C样本均发生组内聚集且组间分离趋势,且在OP1S-DA模式下该趋势更加明显(图4(a)、(C)和图5(a)、(C),这说明海水湿藏36