冰温酶解贮藏对低盐脱水牡蛎滋味的影响.docx

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1、摘要:为了探究冰温酶解贮臧过程中蛋白质降解、呈味核甘酸及其关联物变化对低盐脱水太平洋牡蛎Crassostreag/gas滋味的影响，以牡蛎肉(去壳质量为25.Og5.0g)中注射25U/g风味蛋白酶(F组)和中性蛋白酶(Z组)作为试验组，以注射等量蒸储水作为对照组(D组)，脱水后进行冰温贮藏(-2.00.5),每3d测定一次理化指标(pH、挥发性盐基氮TVBN含量、值、Ca-ATPase活力、总筑基含量、TCA-可溶性肽含量)、游离氨基酸含量和呈味核甘酸含量，并结合电子舌进行分析。结果表明：太平洋牡蛎冰温贮藏过程中，F和Z组在18d内满足鲜度要求，D组在24d内满足鲜度要求；与D组相比，F和Z

2、组蛋白质降解明显，TCA-可溶性肽和游离氨基酸含量显著提高(火0.05),游离氨基酸味道强度(TAV)值上升；肌甘酸(IMP)积累与鲜味氨基酸协同增鲜使得F和Z组味精当量(EUC)与D组相比显著提高(/K0.05)；电子舌分析显示，F、Z和D组滋味差异能被有效区分且酶解前期和后期滋味差异明显。研究表明，冰温酶解能提高低盐脱水牡蛎的多肽及游离氨基酸含量，影响呈味核甘酸降解，对低盐脱水牡蛎起到增鲜作用，其中中性蛋白酶优于风味蛋白酶，本研究结果可为高附加值海珍品加工提供新的思路。关键词：牡蛎；冰温酶解；风味蛋白酶；中性蛋白酶；滋味；电子舌牡蛎是世界上捕捞量最大的贝类，同时也是中国重要的经济贝类之一o

3、因其滋味鲜美、营养丰富而受到关注。呈味氨基酸和核昔酸及其关联物是牡蛎滋味的重要评价指标，但这些指标因养殖区域的不同而受到一定的影响。林海生等研究得出呈味核昔酸主要以腺甘酸(AMP)、肌昔酸(IMP)和次黄喋吟核甘(HxR)为主，但呈味物质会因地域和品种的不同而呈现差异。有研究表明，酶解可以增强近江牡蛎OstrearivuIarisGC)U1d的滋味。而酶解作为一种简单高效的方法,广泛应用于牡蛎活性肽的生产制备。近年来，Qian等利用酶解制备太平洋牡蛎Crassostreagigas多肽，发现其具有较好的抗氧化活性，可能是天然抗炎成分的潜在来源。Wang等得出类似结论，并指出相比温度、PH和水解

4、时间，酶与底物含量的比(E/S)是酶解反应最关键的条件。现已证实，牡蛎多肽具有抗氧化、抑菌、抗疲劳、抗癌、免疫调节及增强性功能等活性。酶解作为一项绿色加工手段常用于海珍品的精深加工，现有酶解工艺通常用于牡蛎肽制备，通过牡蛎匀浆后添加高比例的酶(超过2OOOUg),在最适条件下进行酶解，离心取上清液，采用柱层析或者是膜过滤器截留方式得到牡蛎肽溶液，最后冻干完成牡蛎多肽的制备。该工艺具有加酶量高、酶解时间短的特点，作为一种水产品精深加工方式完全改变了牡蛎原有的食用习惯，且成本较高、提取工艺相对复杂。鲜活牡蛎蛋白质含量约为9%,酶解反应水解度(DH)在30%左右,因此，获得单位质量的牡蛎肽通常需要大

5、量原料进行生产，不可避免造成原料浪费。本研究中，拟利用低盐脱水牡蛎冰温贮藏期长的特点，采用低酶(25Ug)注射结合冰温酶解，以保持牡蛎原有食用习惯的前提下增加其多肽含量，并考察冰温酶解过程中游离氨基酸及呈味核甘酸的变化，以期达到酶解增鲜的目的，为开发高附加值海珍品提供理论依据。1材料与方法1.1材料试验试剂：总毓基（TH）测试盒（北京索莱宝科技有限公司）、超微量Ca-ATPase试剂盒（南京建成生物工程研究所）、稳定型1oWry法蛋白浓度测定试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）、平板计数琼脂（国药集团化学试剂有限公司）、中性蛋白酶（上海麦克林生化科技有限公司）、风味蛋白酶（上海兰拓生物科

6、技有限公司）；氢氧化钠、氢氧化钾、高氯酸、三氯乙酸、氯化钠（国药集团化学试剂有限公司），为分析纯。主要仪器设备：1HS-150HC恒温恒湿箱（上海一恒科学仪器有限公司）、S1FPTAD型多功能酶标仪（上海基因有限公司）、PH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）、TG1-16M型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、全自动凯氏定氮仪（Kje1teC8400,丹麦F0SS）、电子舌（ASTREE,法国A1phaMOS）、基酸全自动分析仪（1-8800,日本HitaChi）、高效液相色谱仪（W2690/5,美国WaterS）、冰温干燥装置（实验室自行研制）（图Do1一冷阱制冷机组；2真

7、空压力变送器；3一手阀；4-放气阀；5电动蝶阀；6止油阀：7真空泵：8漏气阀；9物料：10托盘：11电加热板：12一重量传感器；13真空箱；14一排水阀；15冷阱。1co1dtraprefrigerationunit；2-vacuumpressuretransmitter；3handva1ve；4purgeva1ve；5e1ectricbutterf1yva1ve；6oi1checkva1ve；7一vacuumpump；8-air1eakageva1ve；9materia1；10tray；11e1ectricheatingp1ate；12weightsensor；13vacuumbox；14d

8、rainva1ve；15co1dtrap.图1冰温干燥装置Fig.1Acontro11edfreezing-pointdrieddevice12方法1.2.1样品处理原料处理：新鲜太平洋牡蛎购自上海市南汇新城镇农贸市场，去壳质量为(25.05.0)g,含水率为80%2%。开壳取肉后按含盐量1%进行饱和食盐水注射，以牡蛎肉中注射25U/g风味蛋白酶和中性蛋白酶作为试验组，以注射等量蒸储水作为对照组。具体操作以去壳质量为25.0g的牡蛎为例进行说明。盐水注射：室温20C下食盐溶解度为36g100g水，密度为1.33gcm1,36g食盐溶解于100g水后体积约102.3m1,25.0g牡蛎按照1%含

9、盐量计算需要注射食盐0.25g,则需要注射饱和食盐水体积匕根据下式V1102.3m10.25g36.0g计算得K=O.71m1o酶液注射：试验所用中性蛋白酶的酶活性为50000Ug,风味蛋白酶的酶活性为100000Ugo取2.0g中性蛋白酶和1og风味蛋白酶分别用蒸储水定容至100m1,此时酶活性为1000Um1,则25.0g的牡蛎需注射酶液K,根据下式25.0g25U/g_V21000U1.0m1/计算得K=O.63m1o注射均使用2.5m1无菌注射器对牡蛎进行操作，以闭壳肌几何中心和沿鲤丝方向约5mm的牡蛎组织作为注射点，缓慢注射，闭壳肌周围均匀渗液，牡蛎组织缓慢充盈视为注射均匀。1.2.

10、2 试验设计试验设3组，分别为注射蒸播水的对照组(D组)及注射风味蛋白酶(F组)和中性蛋白酶(Z组)的酶解组。原料经注射处理后进行冰温脱水(-2.0C0.5C)处理，通过质量传感器在电脑界面实时显示牡蛎含水率，待含水率下降至目标含水率(60%1%)时终止脱水。脱水后的样品进行单个封装，冰温(-2.00.5)贮藏，每3d进行一次指标测定。1.2.3 PH测定参考Chen等的方法略有改进。测定前将样品在室温下放置30min,然后切碎取肉糜5.0g,加入蒸僧水45m1均质30s,4000r/min离心10min,取上清液进行PH测定,每3d测量一次。1.2.4挥发性盐基氮(TVBN)、总筑基含量测定

11、及人值计算依据食品中挥发性盐基氮的测定(GB5009.2282016)中的分析方法测定TVBN含量。参照试剂盒说明书操作测定总筑基含量。4值计算公式为HxHxRK=ATPADP+MPIMPHx+HxRX1007e其中：ATP为三磷酸腺昔，ADP为二磷酸腺甘，AMP为腺甘酸，IMP为次黄噂吟核甘酸，HXR为次黄噂吟腺甘，HX为次黄噂吟，单位均为Umo1/goTVBN和4值通常用来评价水产品的新鲜程度，牡蛎贮藏过程中通常以TVBN值为20mgN/100g作为劣变界限。值低于20%认为是一级鲜度，20%60%属于二级鲜度，否则视为腐败。1.2.5 Ca-ATPase活力测定粗酶液的制备参考陈海强等的

12、方法略有改进。准确称取牡蛎肉糜2.0g,加入4C预冷蒸镭水18m1,冰水浴匀浆10s,取匀浆液2m1,加入98m1生理盐水混合均匀，根据超微量CaTTPase测定试剂盒操作步骤进行。酶活力定义：每小时每克样品中ATP酶分解ATP产生1mo1无机磷的量为1个ATP酶活力单位(U)。1.2.6 TCA-溶解肽和游离氨基酸含量测定取3g样品沸水浴灭酶IOmin,加入27m15%(质量分数)的TCA溶液，匀浆InIin,置于4冰箱1h,低温离心(4,12000rmin)10mio以牛血清蛋白(BSA)作为标准品，采用1OWry等的方法进行测定，结果以mg/g牡蛎样品表ZjsO参考Wang等的方法略有改

13、进。称取2.Og样品沸水浴灭酶10min,加入15m15%(质量分数)的三氯乙酸溶液，匀浆，超声处理5min,4静置2h,低温离心(4,10000rmin,10min),取上清液5.0m1,用氢氧化钠溶液(分别为6、1mo11)调节PH为2.0,10m1容量瓶定容，摇匀后用0.22Um水相滤膜过滤打入氨基酸全自动分析仪进样瓶进行测定。1.2.7 呈味核甘酸及其关联化合物含量测定参考徐美禄等的方法略有改进。取5.0g牡蛎肉沸水浴灭酶10min,加入10m110%(质量分数)的高氯酸溶液匀浆，超声处理5min后进行离心(4C,10000rmin,15min),取上清液，用5%(质量分数)的高氯酸5

14、m1洗涤沉淀，相同条件下离心，合并两次上清液。使用氢氧化钾溶液(分别为6、1mo11)调节PH为6.5,50m1容量瓶定容，摇匀后用0.22Uin水相滤膜过滤打入进样瓶进行测定。试验采用G1Inertsi1ODS-3色谱柱(4.6IDX250mm)等梯度洗脱，柱温为30,流速为1m1min,进样量为101,紫外检测波长为254nmo流动相：A为甲醇，B为0.02mo1/1磷酸二氢钾和磷酸氢二钾溶液(PH5.8)o1.2.8味道强度值(tasteactivityva1ue,TAV)和味精当量(equiva1entumamiconcentration,EUC)的计算TAV体现某呈味物质对呈味的贡献

15、，其计算公式为TAV=CZTo其中：。为样品中某呈味物质含量(mg/g)；7为该呈味物质阈值。味精当量(EUC)表示呈味核昔酸混合物与鲜味氨基酸二者协同作用所产生的鲜味强度，是以谷氨酸钠(MSG)的含量来表示100.0g样品中总呈鲜物质的量，其计算公式为EUC=(a。)+1218Eb)(a,b)。其中:EUC为味精当量(gMSG/100g)；a为鲜味氨基酸ASP和G1U的含量(g100g)；6为ASP和G1U相对于MSG的鲜度系数(其中G1U=10,Asp=O.077)；a为呈味核甘酸GMP、IMP、AMP的含量(g1为g)；A为呈味核甘酸相对于IMP的鲜度系数(其中IMP=10,GMP=2.

16、3,AMP=O.18)；1218为协同作用系数。1.2.9电子舌分析参考从娇娇等的方法略有改进，主成分分析(PCA)由A1phaSoftV12.0软件完成。取5.0g牡蛎肉沸水浴灭酶10min,加入25.0In1超纯水，匀浆，超声处理5min,4静置30min,离心(4,12000rmin,15min),过滤，沉淀重复进行以上操作一次，合并两次上滤液定容至100In1待用。电子舌进样杯进样量为5.0m1,加75In1超纯水定容，每秒采集一次数据，采集时间120s,取第120S响应值，每个样品平行取3个样。酶解过程中，辨别指数(DI值)表征不同样品滋味轮廓区分度，样品数据点无重叠时DI值为正，值越大区分度越高；有重叠时D