石油污染土壤微生物群落分布特征.doc

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1、石油污染土壤微生物群落分布特征摘要：采用高通量测序法研究东营某炼油厂不同污染程度的土壤中细菌、真菌和古菌的群落结构，分析石油污染对土壤微生物群落结构的影响。结果表明：微生物群落可操作分类单元(OTU)数量随着油污土壤油含量的增加先增多后减少；Beta多样性与土壤石油污染程度有一定的关系；受污染程度相近的土壤样品，微生物群落结构的相似度较高。细菌、真菌、古菌群落中相对丰度最大的分别为变形菌门(Proteobacteria)、子囊菌门(Ascomycota)和奇古菌门(Thaumarchaeota)，分别为44.8%79.5%、54.4%83.2%和28.3%93.1%。属水平群落聚类分析结果显示

2、，随着土壤油含量增加，真菌踝节菌属(Talaromyces)的相对丰度由0增加到31.6%，细菌寡养单胞菌(Stenotrophomonas)由0.1%增加到1.9%，古菌甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)由5.8%增加到37.8%。微生物群落结构与土壤中烃类组分含量相关性分析发现，真菌炭疽菌属(Colletotrichum)、细菌节杆菌属(Arthrobacter)、古菌盐红菌属(Halorubrum)与烷烃含量呈显著正相关性，细菌甲基杆菌属(Methylobacterium)、古菌甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)与芳香烃含量呈显著正相关性。关键词：油污土壤；微生物

3、群落结构；高通量测序；生物修复石油是一种重要的能源，在促进经济发展的同时也带来了大量的环境问题。在石油开采、储运和生产加工等过程中，不可避免地会对土壤、地表水及地下水造成不同程度的污染。其中，在油田和油井钻凿过程中对周围土壤的污染、石油开采过程中形成的落地油、输油管路的渗漏等，是土壤石油污染的主要途径1。石油污染物可以影响土壤的微生物群落结构2-10。微生物与环境的相互作用是微生物在各种不同环境中生存和繁殖的关键。其中，土壤细菌群落是土壤微生物中数目最多、分布最广且成分最丰富的微生物之一，土壤真菌是土壤微生物的主要成员，古菌是土壤中存在的一种特殊的生命形式。它们共同作为土壤生态系统的重要组成部

4、分，在碳循环、氮循环等生物地球化学进程中起着不可替代的作用。同时，土壤的理化性质和生物学特征也被土壤微生物通过不同途径改变，包括有机质的合成分解、污染物降解、养分固定与释放等11-17。目前，对土壤微生物群落结构的研究可采用变性梯度凝胶电泳、实时荧光定量PCR、荧光原位杂交、序列标签标记的高通量测序以及宏基因组等技术。其中，高通量测序技术具有高准确度、低成本等优势18-19。因此，笔者采用高通量测序技术对不同污染程度的石油污染土壤样品中细菌、真菌以及古菌群落结构进行研究，探究微生物群落分布及其与石油污染土壤性质之间的关系，为深入认识油污土壤微生物群落分布特征以及油污土壤的高效生物修复技术的建立

5、提供理论基础。1 实验部分1.1 原料和试剂实验试剂：牛肉浸膏、胰蛋白胨、琼脂粉，BR，国药集团化学试剂有限公司产品；氯化钠、无水硫酸钠、四氯化碳、碳酸氢钠、正己烷，AR，上海泰坦科技股份有限公司产品；硅酸镁、氯化钾、重铬酸钾、浓硫酸、邻菲罗啉、硫酸亚铁、钼锑抗、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、浓盐酸、高锰酸钾、硅胶，AR，国药集团化学试剂有限公司产品；二氯甲烷、氢氧化钠，AR，西陇科学股份有限公司产品。油污土壤样品：油污土壤采集地点位于东营某炼油厂(东经1185，北纬3815)的油罐区(YGQ)、污油场(WYC)、垃圾场(LJC)3个地点，各采集 020 cm 上层土壤样品和2050 cm下层土壤样

6、品，分别记为YGQ0-20、YGQ20-50、WYC0-20、WYC20-50、LJC0-20、LJC20-50。将各土壤样品去除植物根系和石块后经2 mm尼龙筛过筛，备用。1.2 土壤性质测定方法采集的新鲜土壤样品立即采用烘干法进行含水率的测定，并采用平板计数法测量细菌总数。土壤样品风干后进行其他性质的测定。其中，采用筛分法测定土壤粒径，采用酸度计法测定土壤pH值，采用电导率仪测定土壤电导率，采用重铬酸钾容量法测定土壤有机质含量，采用凯氏定氮法测定土壤全氮含量，采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗分光光度法(TU-1901双光束紫外可见分光光度计)测定土壤有效磷含量，采用四氯化碳萃取-红外分光光度法(红

7、外光度测油仪2000-，吉林欧伊尔环保科技发展有限公司产品)测定土壤油含量，采用比重瓶法测定土壤密度。对于测定的土壤性质均进行3次测定取平均值。1.3 油污土壤烃类组分分析方法油污土壤样品用二氯甲烷萃取后脱水、浓缩后过层析柱，饱和烃和芳香烃洗出液均浓缩到0.9 mL，分别加入100 L正构烷烃内标(C24D50，100 g/mL)和100 L多环芳烃内标(d14-三联苯，20 g/mL)，定容后采用安捷伦科技有限公司生产的7890A-5975C GC-ms联用仪(配备MS5975型质谱检测器和30 m0.25 mm0.25 m的HP-5ms毛细管色谱柱)测定萃取液中烃类组分，并计算油污土壤中烃

8、类组分的质量分数。色谱条件：高纯N2为载气，流速为1.0 mL/min；进样口温度为280 ；进样方式为不分流；升温程序为初始温度50 保持5 min，以升温速率 6 /min 升温至300 并保持20 min。质谱条件：电子轰击电离源，离子源温度280 ，采用全扫描(SCAN) 模式。土壤样品中烃类组分含量(质量分数)计算方法如式(1)(3)所示20。(1)(2)(3)式中：FRR(Relative response factor)为相对响应因子；AC0和AC1为标准样品和所测样品中组分峰面积；AI0和AI1为标准样品和所测样品中内标峰面积；mC0和mC1为标准样品和所测样品中组分质量，g；

9、mI0和mI1为标准样品和所测样品中内标质量，g；n为稀释倍数；V1为所测样品体积，mL；V2为油污土壤萃取液总体积，mL；mT为土壤的质量，g；wT为土壤中组分质量分数，g/g。1.4 高通量测序及统计分析将采集的新鲜土壤样品进行脱氧核糖核酸(DNA)提取和高通量测序。采用分光光度计(Nano)进行紫外定量检测总DNA，采用Q5高保真DNA聚合酶进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并采用AXYGEN公司生产的凝胶回收试剂盒对目标片段进行切胶回收。参照电泳初步定量结果，将PCR扩增回收产物进行荧光定量。根据荧光定量结果，按照每个样品的测序量需求，对各

10、样品按相应比例进行混合。最后，采用Illumina MiSeq平台对土壤样品真菌、细菌、古菌群落DNA片段进行双端测序。使用QIIME软件，调用UCLUST这一序列比对工具，对前述获得的序列按照97%的序列相似度进行归并和可操作分类单元(Operational taxonomic unit，OTU)划分，并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列。使用QIIME软件，获取各样品在门、纲、目、科、属5个分类水平上的组成和丰度分布表。通过主成分分析研究样品Beta多样性，对群落数据结构进行自然分解并通过对样品排序，观测样品之间的差异。采用Chao1丰富度指数、ACE丰富度指数、Shan

11、non多样性指数和Simpson多样性指数来反映其Alpha多样性，使用QIIME软件分别对每个样品计算上述4种多样性指数。使用R软件，对丰度前50位的属进行聚类分析并绘制热图。分析油污土壤微生物群落与土壤烃类组分的相关性，将各样品群落按照门及属水平分别进行整理，分析群落组成受石油污染的影响。2 结果与讨论2.1 油污土壤基本性质图1为油污土壤样品的粒径分布。根据土壤的分类和定名标准21，YGQ0-20、YGQ20-50、WYC0-20、WYC20-50、LJC0-20为粗砂，LJC20-50为中砂。表1为油污土壤的基本性质。由表1可以看出，YGQ0-20土壤样品含水率最低，仅为1.35%(质

12、量分数)，其次为WYC0-20，含水率为14.25%，其余土壤样品含水率均在20%以上。从土壤pH值可以看出，LJC0-20和LJC20-50为弱碱性土壤，其余样品为中性土壤，油污程度对pH值没有明显的影响。WYC0-20土壤样品中油质量分数最高为8.632 g/kg，其次为LJC0-20；YGQ取样点油含量明显低于WYC、LJC两点，YGQ20-50油含量最低；油污土壤样品的油含量与有机质含量呈正比关系。土壤有效磷质量分数为0.614.0 mg/kg，全氮质量分数为979 mg/kg，且油含量与有效磷含量和全氮含量无明显的相关性。图1 油污土壤样品粒径分布Fig.1 Particle siz

13、e distributions of oil-contaminated soil samples表1 油污土壤基本性质Table 1 Properties of oil-contaminated soil samples油污土壤中烃类组分含量如图2所示。YGQ取样点正构烷烃含量明显低于WYC、LJC两点，烷烃质量分数均低于2.5 g/g，碳数范围分布在C16C31，但芳烃质量分数较高，最高达到2.0 g/g。YGQ取样点C10C15范围的正构烷烃含量较低，YGQ0-20中C18C21范围的正构烷烃含量高于YGQ20-50，YGQ20-50中C22C28范围的正构烷烃含量相对较高。YGQ0-20

14、中芳香烃的种类和含量远大于YGQ20-50，相对含量较高的有萘、菲、芴、蒽和芘，苯、二苯并噻吩和含量较低。YGQ20-50中含有少量的苯、菲、蒽和芘。WYC取样点C9C15范围的正构烷烃含量较低，WYC0-20中C16C21范围的正构烷烃含量明显高于WYC20-50。WYC0-20中芳香烃含量高、种类多，主要为苯、萘、菲、二苯并噻吩、芴、蒽和芘，其中，菲和芘的含量较高。WYC20-50中碳数范围在C22C32的正构烷烃含量较高，芳香烃质量分数均低于0.50 g/g，含有菲、和芘以及少量的萘和蒽。相比YGQ、WYC两点，LJC取样点烷烃质量分数最高(最高超过10 g/g)，但芳香烃质量分数最低(

15、均低于0.32 g/g)。LJC0-20中正构烷烃碳数范围在C13C24之间含量较高，且LJC0-20中芳香烃含量也明显高于LJC20-50，苯、萘、菲、和芘含量较高。LJC20-50中碳数范围在C25C30的正构烷烃含量较高，芳香烃以少量菲、芘为主。F1Normal paraffin; F2Aromatic hydrocarbonsAAnthracene; BBenzene; CChrysene; DDibenzothiophene; FFluorene; NNaphthalene; PPhenanthrene; IPyrene图2 油污土壤中烃类组分含量分布Fig.2 Hydrocarbo

16、ns mass fraction in oil-contaminated soil samples(a) YGQ-F1; (b) YGQ-F2; (c) WYC-F1; (d) WYC-F2; (e) LJC-F1; (f) LJC-F2综上所述，可以认为油污土壤中正构烷烃碳数范围主要分布在C13C32，同一取样点上层土壤中碳数范围在C16C21的正构烷烃含量较高，而下层土壤中C22C30的正构烷烃含量较高。上层土壤中芳香烃的种类和含量明显高于下层土壤。2.2 油污土壤中微生物群落多样性指数分析2.2.1 油污土壤的微生物群落丰富度及多样性6个土壤样品通过质量筛查，且Index完全匹配时共获得272199条有效ITS序列、227067条有效细菌序列、210468条有效古菌序列。将以97%