秸秆蓝藻混合发酵产沼气过程中微生物群落分析.doc

《秸秆蓝藻混合发酵产沼气过程中微生物群落分析.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《秸秆蓝藻混合发酵产沼气过程中微生物群落分析.doc（17页珍藏版）》请在第一文库网上搜索。

1、秸秆蓝藻混合发酵产沼气过程中微生物群落分析摘要：采用实验室自制秸秆蓝藻混合厌氧反应装置进行沼气发酵实验，利用16S rNA基因克隆文库的方法，对不同产气阶段的细菌和古菌的优势菌群进行多样性研究。结果表明：不同产气阶段细菌优势种类存在差异，供试秸秆沼气反应器阶段细菌种类较为丰富，分属于6个门：产气初始阶段优势菌群为变形菌门（Proteobacteria），相对丰度为51.76%；产气高峰阶段优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes），相对丰度为47.13%；产气结束阶段优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes），相对丰度为28.89%；此外，还包括绿弯菌门、螺旋体门、绿菌门的细菌。古菌种类明显少

2、于细菌，均属于甲烷微菌纲（Methanomicrobia）、甲烷杆菌纲（Methanobacteria）和热原体纲（Thermoplasmata）。秸秆蓝藻沼气系统微生物群落结构的阐明具有一定的意义，可为秸秆沼气工程调控提供科学依据。安徽省作为农业大省，每年都有大量的秸秆产生，主要农作物秸秆年理论资源量达4487.99万t，年可收集资源量达3878.84万t1。秸秆作为农业生产中的副产品是一种容易获取的生物能源，然而大量的秸秆被随意丢弃和焚烧，造成了极大的资源浪费和环境污染2。巢湖是中国第五大淡水湖，连通长江，巢湖的水质不仅会影响到其周边环境，还会影响到整个长江流域。巢湖水体近年来富营养化严重

3、，蓝藻暴发成为环境问题。蓝藻含丰富的有机质，是一种生物质资源3。厌氧发酵可以使秸秆和蓝藻转化为清洁能源，既保护了环境也使资源得到了利用4。秸秆是一种富含木质纤维素与其他多糖的有机质，而蓝藻中含丰富的蛋白质和藻多糖，利用含氮量比较丰富的蓝藻调节底物的碳氮比，可以提高发酵的效率5-6。彭书传等利用玉米秸秆和巢湖蓝藻进行混合厌氧发酵，与单一的玉米秸秆或蓝藻发酵过程相比，玉米秸秆和蓝藻混合发酵能够有效促进沼气的生成7。有机物厌氧降解过程主要分为水解发酵、产氢产乙酸及产甲烷3个阶段。其中水解发酵与产氢产乙酸阶段主要由细菌参与，涉及一系列复杂的化学代谢过程，生成乙酸等挥发性有机酸；而产甲烷阶段主要由甲烷古

4、菌参与，将乙酸转化为甲烷8。沼气发酵过程需要不同阶段的微生物相互协作完成，因此沼气发酵过程中的微生物群落结构和功能的解析已经成为研究的热点9。目前国内外关于利用秸秆进行发酵的微生物群落研究主要集中在秸秆和禽畜粪便等常规原料的混合上10，而以秸秆和蓝藻混合发酵为对象的研究鲜有报道。分子生物学技术在微生物鉴定方面的应用，可以研究微生物在厌氧发酵过程中变化情况11-13。本文在秸秆蓝藻混合厌氧产气的基础上，通过构建16S rNA基因克隆文库，了解混合发酵不同阶段的细菌和古菌的优势菌群及其变化规律，为调控混合发酵过程提供微生物基本信息。结合不同产气阶段的产气率，解析沼气发酵各阶段优势微生物的功能，为优

5、化秸秆沼气发酵工艺提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1实验材料 实验所用水稻秸秆采自安徽省周边某稻田，总固体（TS）含量为91.1%，挥发性固体（VS）含量为85.9%，晒干后剪至1cm左右待用；新鲜蓝藻采自巢湖塘西河口，总固体（TS）含量为1.96%，挥发性固体（VS）含量为91.58%，经滤网滤水后装入自封袋置于冰箱冷冻备用，实验时常温解冻待用；接种污泥采自实验室35中温厌氧发酵反应器剩余污泥，TS=3.9%，VS=72.51%，pH=7。1.1.2实验装置 实验装置主要由发酵瓶、集气瓶、集水瓶组成（见图1）。1.2方法1.2.1发酵与取样 将处理后秸秆与解冻新鲜蓝藻按碳氮比为2

6、51混合成发酵原料。将原料分别置于4L厌氧发酵罐中，加入500mL厌氧污泥，配水至2.5L，调节反应总底物的pH至（7.00.05）。混匀后装入反应器内，用氮气对整个装置进行吹氮除氧0.5h以上。密封后进行厌氧发酵，发酵温度35，每天保证人为手动振荡摇晃发酵瓶23次，防止颗粒污泥沉淀或秸秆蓝藻浮于液面。共采样3次，分别在第1、7、29天取样，将样品依次命名为d1、d7、d29。样品采集前，先排空采样管道中残余的厌氧污泥，然后再将厌氧污泥向外流动几分钟后从反应器中取固液混合样30mL装入无菌聚丙烯离心管中，冻存于80超低温冰箱。1.2.2常规测试方法 TS：105烘至恒重；VS：于550马弗炉中

7、烧至恒重；沼气产量：采用水压集气法，每日测量排出的饱和食盐水总量；甲烷含量：采用安捷伦7890A气相色谱测定。1.2.3基因组DNA提取 基因组DNA的提取采用QIAamp DNA Stool mini kit基因组提取试剂盒。为了保证提取样品的基因组DNA的代表性，每个厌氧污泥样品平行提取3次，通过1%琼脂糖凝胶电泳对基因组DNA的提取结果进行检测。1.2.4克隆文库构建 用16S rNA基因通用引物分别对3个样品中的细菌和古菌的16S rNA基因片段进行PC扩增。其中细菌引物序列为27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3），1492（5-TACGGCTACCTTGTTACG

8、ACTT-3）；古菌引物序列为A109F（5-ACKGCTCAGTAACACGT-3），A-912r（5-CTCCCCCGCCAATTCCTTTA-3）。PC反应体系与反应条件：预变性94预变性4min，94变性1min，56退火1min，72延伸2min（古菌16S rNA基因延伸时间1min），共35个循环；最后72延伸10min；4保存。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段并用胶回收试剂盒（TAKAA，大连）进行纯化。纯化的PC扩增产物用pUC-mT载体（生工，上海）依操作说明进行连接，采用热激法将连接产物转化至Trans1大肠埃希菌感受态细胞（全式金，北京）中。通过蓝白斑筛选阳

9、性克隆对于每个克隆文库，随机挑取96个白色克隆子进行PC鉴定，引物采用M13F/M13。1.2.5酶切分型与测序 将鉴定为阳性PC产物的片段用HhaI和HindIII限制性内切酶消化（37），酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，据酶切电泳图，将酶切图谱完全一致的克隆子划分为1个操作分类单元（operational taxo-nomic unit，OTU）14，统计各OTU所含阳性克隆的数量，每个酶切分型选取一个代表克隆送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序。获得的16S rNA基因序列与测定序列在GenBank中进行BLAST同源性检索，使用MEGA6.06软件进行系统发育分析。2结果与分

10、析2.1秸秆蓝藻混合发酵过程曲线发酵期间日产气量及每日甲烷含量如图2所示。反应开始1d快速产气，7d达到产气高峰（397mL）。然后随着原料的减少而逐渐下降，在12d达到第2次产气高峰（300mL）。甲烷浓度在9d达到63%，随后小幅回落后上升，并保持50%以上；前12d为单日产气量较高，12d后进入缓慢增长期；推测在发酵12d后，系统中易产沼气的物质基本利用完毕，后期主要靠分解难降解物质来产沼气。29d产气基本停止。2.2总DNA提取和PC扩增图3为蓝藻秸秆厌氧产气装置中样品总DNA提取电泳图，所用Marker为全式金的Trans15k，图中泳道13、46、79依次为样品d1、d7、d29平

11、行样。由图3可知，提取的基因组较完整，大小在20kb左右，可进行下一步的16S rNA基因片段扩增。图4为样品d7总基因组细菌16S rNA基因PC扩增电泳图，所用Marker为全式金的Trans2KPlus，图中泳道1、2为电泳试验平行样。电泳结果表明PC扩增所产生的DNA片段大小约为1.6kb，说明得到的PC扩增产物适合下一步的16S rNA基因克隆文库的构建。2.3细菌种群群落分析样品d1 96个克隆子阳性克隆85个，共有9个操作分类单元（OTU）；样品d7 96个克隆子阳性克隆87个，共有15个操作分类单元（OTU）；样品d29 96个克隆子阳性克隆90个，共有10个操作分类单元（OT

12、U）。测得有效克隆子16S rNA基因序列在GenBank数据库中进行BLAST比对结果见表1。由表1可知，随机挑选的克隆子与GenBank数据库中已知细菌的序列同源性最高为100%，最低为85%。由比对结果发现，厌氧颗粒污泥中微生物种群丰富，共分6个类群（见表2），分别为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacte-ria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chlo-roflexi）、螺旋体门（Spirochaetes）、绿菌门（Ignavi-bacteriae）。其中厚壁菌门、变形菌门与拟杆菌门为主要优势菌群，分别占3个样品细菌克隆子总数18.82%

13、47.13%、12.64%51.76%、13.33%35.63%。系统中微生物以变形菌和不可培养细菌为主。通过分析不同发酵时间样品细菌群中丰度最大的OTU，可以了解不同发酵时间的重要细菌。3个不同发酵时间细菌群中丰度最大的OTU是不同的（见图5）。d1细菌群中丰度最大的OTU为Pseudomonas sp.，属于变形菌门，占样品d1总克隆子数的30.6%。Pseudomonas sp.分离自土壤，为短杆状，革兰阴性，好氧菌，生长温度为465，可利用葡萄糖，不能水解淀粉15。d7细菌群中丰度最大的OTU为Bacteroides paurosaccharo-lyticus，属于拟杆菌门，占样品d7

14、总克隆子数的27.6%。Bacteroides paurosaccharolyticus分离自稻草残渣，革兰阴性，严格厌氧菌，生长温度为1040，最优35，可优先利用阿拉伯糖、木糖、葡萄糖等，麦芽糖、糊精、糖原、淀粉和果胶也可利用，代谢产生乙酸、丙酸和琥珀酸16。d29细菌群中丰度最大的OTU为Dechloromonas sp.PC1和D.formicoaceticum，D.formicoaceticum属于厚壁菌门，占样品d29总克隆子数的23.3%，是一种严格厌氧的革兰阳性细菌，可利用甲酸、乙酸和少量的甲醇17；Dechloromonas sp.PC1属于变形菌门，占样品d29总克隆子数的

15、24.4%，为革兰阴性短杆菌，微好氧，最适条件为25，pH7。变形菌门是产气初始阶段的优势菌群。该门菌的纯培养主要分离自土壤、粪便、厌氧活性污泥等，可利用淀粉、长链脂肪酸及氨基酸等，具有水解作用，部分细菌有脱氮作用18。结合发酵装置中的物料及接种物，推测该菌很可能来自厌氧污泥或蓝藻；拟杆菌门是产气高峰阶段的优势菌群。该门菌主要分离自海底、肠道、厌氧反应器等厌氧环境，有降解大分子碳水化合物产酸的功能19；厚壁菌门是产气终止阶段的优势细菌种群，该门细菌已在厌氧消化污泥、废水处理反应器20、玉米秸秆厌氧反应器21等环境中被大量发现，主要进行纤维素降解、有机物水解、长链脂肪酸降解，生成小分子物质。2.4古菌种群群落分析样品d196个克隆子阳性克隆85个，共有8个操作分类单元（OTU）；样品d796个克隆子阳性克隆有84个，共有6个操作分类单元（OTU）；样品d2996个克隆子阳性克隆80个，共有4个操作分类单元（OTU）。测得有效克隆子16S rNA基因序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，其微生物所属古菌类别较为丰富（见表3）。在科和属分类水平上（见表4），11个古菌OTUs中可分为Methanoregula、甲烷杆菌属（Methanobacterium）、甲烷微菌属（Metha-nosphaerula）、甲烷八叠球菌属（Methanosa