DB6505T 1272023省际公路检查站口蹄疫监测技术规程.docx

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1、ICS65.020.20CCSB41B6505哈密市地方标准DB6505/T1272023省际公路检查站口蹄疫监测技术规程Monitoringproceduresoffootandmouthdiseaseatprovincia1highwaycheckpoint2023-12-30实施2023-11-30发布哈密市市场监督管理局发布本文件按照GB/T1.1-2023标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由哈密市动物疫病预防控制中心提出。本文件由哈密市农业农村局归口。本文件起草单位：哈密市动物疫病预防控制中心、伊州区动物疫病预防控制中心本文件主要起草人：杨夷平、杨康

2、、陈建豪、段进刚、买吾兰孜克牙、关团、杨娴靖。本文件实施应用中的疑问，请咨询哈密市动物疫病预防控制中心。对本文件的修改意见建议，请反馈至哈密市动物疫病预防控制中心（哈密市八一路26号）、哈密市市场监督管理局（哈密市前进西路14号）哈密市动物疫病预防控制中心联系电话：0902-2317228,传真：0902-2317228,邮编：839000哈密市市场监督管理局联系电话：0902-2250279,传真：0902-2251069,邮编：839000省际公路检查站口蹄疫监测技术规程1范围本文件规定了省际公路检查站开展口蹄疫临床诊断、样品采集和储运、实验室检测、检测结果出具和报告、疑似口蹄疫疫情处理和

3、消毒等技术要求。本文件适用于哈密市域内省际公路检查站开展口蹄疫的监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18935口蹄疫诊断技术GB19489实验室生物安全通用要求GB/T22915口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法NY/T1956口蹄疫消毒技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。11口蹄疫Footandmouthdisease由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病实时荧光RT-PCRrea1

4、-timeRT-PCR实时荧光定量反转录-聚合酶链反应，在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。Ct值cyc1ethresho1d每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环次数。4缩略语下列缩略语适用于本文件O-P液：食道-咽部分泌物(OCSOPhagCa1-PharyngCaIf1uids)PBS：磷酸盐缓冲盐水(PhoSPhatebufferedsa1inebuffer)RNA：核糖核酸(RibOnUCIeiCacid)E1ISA：酶联免疫吸附试验(EnZyn1e1inkedimmunosorbent

5、assay)5临床诊断K1易感动物偶蹄目动物，包括牛、绵羊、山羊和猪对口蹄疫病毒均易感，骆驼易感性较低。R夕临床症状5.2.1易感动物卧地不起，牛可见呆立流涎。5.2.2易感动物唇部、舌面、齿龈、鼻镜、蹄踵、蹄叉、乳房等部位出现水泡。5.2.3发病后期，水泡破溃、结痂，严重者蹄壳脱落，恢复期可见瘢痕、新生蹄甲。41病理变化5.3.1牲畜剖检消化道可见水泡、溃疡。5. 3.2幼畜剖检可见骨骼肌、心肌表面出现灰白色条纹，形色酷似虎斑。K4临床结果判定易感动物出现上述临床症状和病理变化，可判定为疑似口蹄疫动物。6样品采集和储运A1器材食道探杯、猪扁桃体取样器、灭菌手术剪刀和镜子、灭菌样品保存管、灭菌

6、离心管(2m1,15m1)、注射器(5m1)、长颈水桶、自封袋。A)试剂2%氢氧化钠,0.04mo1/1PBS(PH7.4),50%甘油-PBS保存液，O-P液保存液,试剂配方见附录AoA2样品采集6. 3.1采样原则与通用要求7. 3.1.1对判定为疑似口蹄疫牲畜采集3份样品/每头(只)，并做好标记。6.3.1.2采集具有典型临床症状的样品，活畜采集水泡液、水泡皮、O-P液、血清等样品，病死畜解剖采集心肌和颌下淋巴结。6.3.2水泡液采集典型临床发病动物水泡液用灭菌注射器吸出后装入样品保存管，加青霉素1000IUm1链霉500IUm1,加盖封口，冷冻保存。6.3.3水泡皮采集用0.04mo1

7、/1PBS(pH7.4)清洗水泡表面，然后用灭菌手术剪刀剪取水泡皮，2g5g为宜。采集到的水泡皮，装入样品保存管，加50%甘油-PBS保存液，使保存液液而没过样品，加盖封口，冷冻保存。6.3.4组织样品采集如怀疑为口蹄疫的死亡畜，解剖采集心肌和颌下淋巴结IOg,装入自封袋中密封，冷冻保存。6.3.50-P液样品采集6.3.5.1动物在采样前禁食，食道探杯在使用前经2%氢氧化钠浸泡5min消毒，再用洁净水充分冲洗。每采完1头（只）动物，探杯都要进行消毒并充分清洗。6.3.5.2采样时动物站立保定，将探杯随吞咽动作送入被检动物食道上部10cm-15Cn1处，轻轻来回抽拉2次3次，然后将探杯拉出。如

8、采集的0-P液被胃内容物严重污染应舍弃，用洁净水冲洗探杯和被检动物口腔，重新采样。6.3.5.3在15In1离心管中事先加4m1-5m1磷酸盐缓冲液（0.04mo1/1、pH7.4）,将探杯采集到的5m110m1OJ液倒入离心管中，密封后充分摇匀，冷冻保存。6.3.6血清样品采集动物血液，每头应不少于5m1,分离血清后装入2In1灭菌塑料离心管中，加盖密封后冷冻保存。A4样品储运采样结束后,每份样品包装瓶（袋）附一份样品采集登记表，均要写明采集地点、采集车辆信息、货主信息、动物种类、耳标编号、时间等，样品于保温箱中加冰、密封送实验室应不超过24ho样品在送检之前一定要事先通知接收样品的实验室。

9、样品采集登记表见附录Bo7实验室检测71样品制备7.1.1 生物安全措施样品处理的生物安全措施按照GB19489进行。7.1.2 水泡液样品处理将0.5m1水泡液倒入2m1灭菌塑料离心管内，3000r/min离心10min取上清液备用，其余水泡液保存于-70C冰箱中。7.1.3 O-P液样品处理将1.5m10-P液倒入2m1灭菌塑料离心管内，3000r/min离心10min取上清液备用备用，其余O-P液保存于-70C冰箱中。7.1.4 组织样品处理取水泡皮、颌下淋巴结等组织样品2.0g于组织匀浆器中充分研磨，加入磷酸盐缓冲液（0.04mo1/1、Ph7.4）制成1:5的组织悬液，3000r/m

10、in离心Io1nin,取上清液转入2m1灭菌塑料离心管中备用，其余组织保存于-70C冰箱中。7.1.5 血清样品处理将分离后的血清转入2m1灭菌塑料离心管中，加盖密封后备用，其余血清样品冷冻保存。79病原学检测7.2.1病毒核酸提取7.2.1.1应用市售商品化检测试剂盒配套使用的柱式抽提试剂盒，按使用说明书人工提取病毒核酸。7.2.1.2应用市售商品化自动提取试剂盒，按使用说明书在自动核酸提取仪上进行编程并提取核酸。7.2.2检测体系的配制7.2.2.1可用GB/T22915中6.3.1实时荧光PCR扩增试剂配制检测体系。7.2.2.2亦可用市售商品化口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR试剂盒配制检

11、测体系。7.2.3检测条件设置7.2.3.1推荐实时荧光定量RT-PCR反应条件：a)第1阶段，反转录45,30min；b)第2阶段，预变性943min；C)第3阶段，94/10s,45/30s,72/1min,5个循环；d)第4阶段，94/10s,60/30s,40个循环；e)在每个循环的第二步(6060s)收集荧光信号，共40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。7.2.3.2选用商品化口蹄病毒通用型实时荧光RT-PCR试剂盒，参照说明书设置。7.2.4结果分析条件设定读取样本检测结果。一般为自动设置阈值，也可根据正常阴性样本扩增曲线合理调整阈值。7.2.5质控标准7.2.5.1

12、阳性对照Ct值W30并出现特异性扩增曲线。7.2.5.2阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线。7.2.5.3同时满足以上两个条件，实验结果成立。7.2.6结果判定7.2.6.1Ct值W30,且出现典型的扩增曲线，判定为阳性。7.2.6.230Ct值38,判定为可疑，重复测定后仍在可疑区间的样本判为阳性。7.2.6.3无Ct值并且无扩增曲线，判定为阴性。7.2.6.4若选用商品化口蹄病毒通用型实时荧光RT-PCR试剂盒，参照说明书判定。71血清学检测7.3.1根据免疫背景做疑似病料的抗体检测，辅助验证病原学检测结果，推荐使用GB/T18935中16章节非结构蛋白3ABC抗体阻断酶联免疫吸附试验(

13、3ABC-B-E1ISA)方法检测。7.3.2选用口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体检测商品试剂盒。参照试剂盒说明书进行检测。8检测结果出具和报告A1病原学核酸检测为初筛结果，应结合免疫背景和血清学检测结果来判断样品阴阳性，填写检测结果记录单见附录C。ft血清学检测结果仅作为辅助诊断试验，若某样品出现3ABC检测结果阳性，口蹄疫荧光定量RT-PCR核酸检测结果为阴性，可判定该动物曾经感染过口蹄疫病毒。R1若检测结果为阴性，将检测结果报告给检查站负责人；若检测结果为阳性或者可疑，填写样品送检登记表见附录D。9疑似口蹄疫疫情处理01对口蹄疫临床疑似病例运输车辆及牲畜实施隔离、监控，禁止牲畜、车辆随意

14、移动，并对其外环境进行严格消毒。05将疑似口蹄疫阳性样品按照5.4中的要求送往哈密市动物疫病预防控制中心复检。01哈密市动物疫病预防控制中心按此标准复检后仍有阳性或可疑，按上述同样送检要求，送检自治区动物疫病预防控制中心复检，并送国家指定参考实验室确诊。10消毒11车辆和场地的消毒10.1.1 对车辆、停泊场所、道路的消毒，可采用碱类、氯化物或酚化物等消毒剂，以清洗、喷洒等方式消毒，参照NY/T1956口蹄疫消毒技术规范执行。10.1.2 室内、实验室（含精密仪器）消毒，可采用过氧化氢雾化消毒和紫外线照射等方式消毒。13人员及物品消毒10.2.1 参与相关工作人员的手及皮肤裸露的部位进行清洗、

15、消毒，回到驻地后进行淋浴消毒。10.2.2 衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取喷洒、浸泡和洗涤等方式消毒。附录A(规范性)试剂配方A.10.1mo1/1磷酸盐缓冲液(PBS,PH7.4)的配制氯化钠(NaCD85.0g磷酸氢二钠(Na2HPO4)15.49g磷酸二氢钠(NaH2PO4)2.03g加蒸储水至1000m1或者：氯化钠(NaCI)80.0g氯化钾(KCI)2.0g磷酸氢二钠(Na2HPO4-12H2O)30g磷酸二氢钾(KH2PO4)2g加蒸镭水至1000m1A.20.04mo1/1PBS(pH7.4)的配制0.1mo1/1PBS400m1蒸水600m1103kPa高压蒸汽灭菌30min,室温或4C冰箱保存A.350%甘油-PBS保存液的配制0.04mo1/1PBS与纯甘油等量混和，调整PH至7.4,分装成小瓶。103kPa高压蒸汽灭菌30min,室温或4冰箱保存。A.40-P液保存液的配制Eag1es-MEM营养液50m10.5%水解乳白蛋白/Ear1es液50m15%碳酸氢钠